本发明专利技术公开了一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，属于生物检疫的技术领域。该方法用MDBK细胞系繁殖BVDV，再用间接免疫荧光方法检测病毒，具体包括S1.MDBK细胞的培养；S2.BVDV的接种；S3.间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒：洗涤、丙酮固定、一抗孵育、二抗孵育和结果判定。本发明专利技术方法能够快速、准确检测出BVDV粒子的活性，稳定检测出猪瘟活疫苗中污染的BVDV，应用于疫苗中牛源原材料污染BVDV的检测，为制备纯净的猪瘟弱毒活疫苗提供更有效的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检疫的
，具体涉及。
技术介绍
牛病毒性腹?写病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV),又称牛病毒性腹?写-粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus, BVD-MDV),属于黄病毒科(Flavivixidae)、痕病毒属(Pestivirus)的成员。该病毒与猪痕病毒(Classical swinefever virus, CSFV)为同一个属。牛血清、冷冻胚胎、牛精液等牛源产品都可能污染BVDV,造成BVDV的传播。在兽用疫苗生产中，常使用牛血清、牛睾丸细胞、胰酶等牛源材料作为原材料。因此，一旦这些原材料中若有BVDV病原，会导致疫苗污染，尤其是猪用疫苗污染后，会导致免疫猪感染BVDV，造成自身类似猪瘟的临床症状给猪瘟的诊断带来困难外，还会成为BVDV的污染源。 目前，为了预防BVDV的传播和流行，国内研究人员建立的检测方法主要有病毒分离、电镜观察、琼脂扩散法、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验、RT-PCR技术等。常规的检测方法费时费力，灵敏度低等缺点。常规的检测方法存在费时费力，灵敏度低等缺点。随着生物技术水平的发展，荧光定量RT-PCR方法的出现，为BVDV的检测提供了一种有力的工具。而荧光定量RT-PCR与普通RT-PCR相比具有灵敏性更强、特异性更好、污染几率小、自动化高、高通量等优势，因而成为一种越来越重要的检测技术。虽然BVDV的荧光定量RT-PCR方法具备上述优点，但是只能检测到BVDV的核酸，不能判断BVDV粒子是否具有感染性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供，该方法能够快速、准确检测出BVDV粒子的活性，稳定检测出猪瘟活疫苗中污染的BVDV，应用于疫苗中牛源原材料污染BVDV的检测，为制备纯净的猪瘟弱毒活疫苗提供更有效的检测方法。 本专利技术的目的通过以下技术方案来实现:，它包括以下步骤:51.MDBK细胞的培养将长满单层的MDBK细胞，用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以2?4X 15个/ml的密度接种于96孔板，每孔100 μ 1，置于37°C 5% CO2的条件下培养，24h后细胞贴壁铺满孔底；其中，所述生长液为含有10%马血清的MEM培养基； 52.BVDV的接种用步骤SI培养的MDBK细胞接种BVDV，添加含2%的马血清至每孔200 μ 1，培养72h，同时设不接种BVDV的MDBK细胞作为阴性对照；53.间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒 531.洗涤:将灭菌预冷的PBS洗去96孔板细胞残留的生长液，洗涤2?3次，每次4 ?6min ；532.丙酮固定:用丙酮固定30?60min，PBS冲洗洗漆2?3次，每次4?6min；533.一抗孵育:用PBS稀释羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，湿盒37°C孵育45?90min，PBS冲洗洗涤2?3次，每次4?6min ； 534.二抗孵育:再用PBS稀释兔抗羊IgG FITC 二抗，湿盒37°C孵育45?90min，PBS冲洗洗漆2?3次，每次4?6min ；535.结果判定:将96孔板放在倒置显微镜上观察，判定结果。 进一步地，步骤SI中所述长满单层MDBK细胞的培养方法为:MDBK细胞在细胞培养瓶中培养，生长液为含有10%马血清的MEM培养基，在37°C 5% CO2的恒温培养箱中培养，2?3天传代一次，长满单层MDBK细胞。 进一步地，步骤S32中所述丙酮温度为O?10°C，浓度为50%?80%。 进一步地，步骤S33中所述羊抗牛BVDV多克隆血清一抗的稀释倍数为50?400倍。 进一步地，步骤S34中所述兔抗羊IgG FITC 二抗的稀释倍数为为50?800倍。 本专利技术中结果判定:观察到阳性细胞的细胞核或细胞质内有特异性亮绿色荧光，而阴性对照、空白对照无特异性绿色荧光，如图1所示。由荧光强弱，其结果判定有如下的几种情况:没有出现或见微弱荧光为“阴性”，弱荧光且少于5%为“弱阳性”，出现明亮绿色荧光且比例为5%?50% 为“中等阳性”，出现耀眼绿色荧光且分布比例大于50%为“强阳性”。 本专利技术的方法不能用于诊断，用于临床检测和科研领域，主要包括对猪瘟兔化弱毒活疫苗中BVDV污染的检测。 本专利技术具有以下优点:本专利技术的一种牛病毒性腹泻病毒的检测方法能够快速、准确检测出BVDV粒子的活性，稳定检测出猪瘟活疫苗中污染的BVDV，应用于疫苗中牛源原材料污染BVDV的检测，为制备纯净的猪瘟弱毒活疫苗提供更有效的检测方法。 【附图说明】 图1为牛病毒性腹泻病毒在MDBK细胞上的特异性荧光斑及阴性对照图。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的描述，本专利技术的保护范围不局限于以下所述。 实施例1:，它包括以下步骤: S1.MDBK细胞的培养MDBK细胞在细胞培养瓶中培养，生长液为含有10%马血清的MEM培养基，在37°C 5%CO2的恒温培养箱中培养，2天传代一次，长满单层MDBK细胞。用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以2X 15个/ml的密度接种于96孔板，每孔100 μ 1，置于37°C 5% CO2的条件下培养，24h后细胞贴壁铺满孔底；其中，所述生长液为含有10%马血清的MEM培养基； 52.BVDV的接种用步骤SI培养的MDBK细胞接种BVDV，添加含2%的马血清至每孔200 μ 1，培养72h，同时设不接种BVDV的MDBK细胞作为阴性对照；53.间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒531.洗涤:将灭菌预冷的PBS洗去96孔板细胞残留的生长液，洗涤2次，每次4min；532.丙酮固定:用温度为0°C，浓度为50%的丙酮固定30min，PBS冲洗洗涤2次，每次4min ；533.一抗孵育:用PBS稀释羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，羊抗牛BVDV多克隆血清一抗的稀释倍数为50倍，湿盒37°C孵育45min，PBS冲洗洗涤2次，每次4min ；534.二抗孵育:再用PBS稀释兔抗羊IgG FITC 二抗，兔抗羊IgG FITC 二抗的稀释倍数为50倍，湿盒37°C孵育45min，PBS冲洗洗涤2次，每次4min ；535.结果判定:将96孔板放在倒置显微镜上观察，判定结果。 实施例2:—种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，它包括以下步骤:51.MDBK细胞的培养MDBK细胞在细胞培养瓶中培养，生长液为含有10%马血清的MEM培养基，在37°C 5%CO2的恒温培养箱中培养，3天传代一次，长满单层MDBK细胞。用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以4X 15个/ml的密度接种于96孔板，每孔100 μ 1，置于37°C 5% CO2的条件下培养，24h后细胞贴壁铺满孔底；其中，所述生长液为含有10%马血清的MEM培养基； 52.BVDV的接种用步骤SI培养的MDBK细胞接种BVDV，添加含2%的马血清至每孔200 μ 1，培养72h，同时设不接种BVDV的MDBK细胞作为阴性对照；53.间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒531.洗涤:将灭菌预冷的PBS洗去96孔板细胞残留的生长液，洗涤3次，每次6mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，它包括以下步骤：S1. MDBK细胞的培养将长满单层的MDBK细胞，用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以2～4×105个/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，置于37℃ 5% CO2的条件下培养，24h后细胞贴壁铺满孔底；其中，所述生长液为含有10%马血清的MEM培养基；S2. BVDV的接种用步骤S1培养的MDBK细胞接种BVDV，添加含2%的马血清至每孔200μl，培养72h，同时设不接种BVDV的MDBK细胞作为阴性对照；S3. 间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒 S31.洗涤： 将灭菌预冷的PBS洗去96孔板细胞残留的生长液，洗涤2～3次，每次4～6min； S32.丙酮固定：用丙酮固定30～60min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min； S33. 一抗孵育：用PBS稀释羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，湿盒37℃孵育45～90min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min； S34. 二抗孵育：再用PBS稀释兔抗羊IgG FITC二抗，湿盒37℃孵育45～90min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min； S35. 结果判定：将96孔板放在倒置显微镜上观察，判定结果。...
【技术特征摘要】
1.一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，它包括以下步骤: 51.MDBK细胞的培养 将长满单层的MDBK细胞，用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以2?4X 15个/ml的密度接种于96孔板，每孔100 μ 1，置于37°C 5% CO2的条件下培养，24h后细胞贴壁铺满孔底；其中，所述生长液为含有10%马血清的MEM培养基； 52.BVDV的接种 用步骤SI培养的MDBK细胞接种BVDV，添加含2%的马血清至每孔200 μ 1，培养72h，同时设不接种BVDV的MDBK细胞作为阴性对照； 53.间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒 531.洗涤:将灭菌预冷的PBS洗去96孔板细胞残留的生长液，洗涤2?3次，每次4 ?6min ； 532.丙酮固定:用丙酮固定30?60min，PBS冲洗洗漆2?3次，每次4?6min； 533.一抗孵育:用PBS稀释羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，湿盒37°C孵育45?90min，PBS冲洗洗涤2?3次，每次4?6min ； 534.二抗孵育:再...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐宏军，黄杰，岳丰雄，张奕强，柏菊，王洁清，胡来根，王家福，
申请(专利权)人：成都天邦生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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