一种H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种H9亚型禽流感病毒的分离鉴定方法，属于病毒检测领域。本发明专利技术的方法是将病毒样品经终浓度6‑12μg/ml的胰酶孵育10‑20min后，接种于悬浮MDCK细胞，培养4‑6天后，检测HA效价；HA试验中，样品HA效价不低于4log2，则为阳性。本发明专利技术的方法可以方便、快速地检测出H9亚型禽流感病毒，且灵敏度高于传统的鸡胚检测法，应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
一种H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法
本专利技术属于病毒分离鉴定领域。
技术介绍
禽流感病毒可引起的人和动物的感染，根据致病性强弱，将禽流感分为高致病性禽流感和低致病性禽流感，其中H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，广泛存在于养殖场中，尽管各级农业部门和养禽企业采取了多种防治措施，但该病对养禽业仍造成了巨大的损失。禽流感分离鉴定能对环境中的禽流感病毒进行监控和预警，是防控禽流感疫情的重要手段。禽流感分离鉴定包括分离和鉴定两部分。鉴定的目的是对病原体进行病毒种类的识别。常见的鉴定方法包括血清学方法和分子生物学方法等。血清学方法包括血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、琼脂凝胶扩散(AGP)试验、神经氨酸酶抑制试验(NIT)、病毒中和试验(VNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。分子生物学方法包括PCR、逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、基因芯片、DNA测序等等。而分离的目的是将病原体纯化和扩增，达到足以被准确鉴定的病原体含量水平。分离的效率直接关系到鉴定的准确性。常见的分离方法是将样品进行有限稀释(可省略)，再接种到SPF鸡胚或犬肾传代细胞(MDCK细胞)中进行培养。SPF鸡胚是隔离养殖的、不带有禽类流行传染病病原的鸡所产的蛋，其费用较高；且鸡胚对有些血清型的病毒的敏感性不够，且分离出来的病毒抗原性变异比较大，容易产生假阴性。MDCK细胞相对费用较低，但其对H9亚型禽流感的敏感性仍然有待提高。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种新的H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法。本专利技术的技术方案包括：一种H9亚型禽流感病毒分离方法，其特征在于，它包括：将病毒样品经终浓度6-12μg/ml的胰酶孵育10-20min后，接种于悬浮MDCK细胞，培养4-6天。进一步的，所述培养环境温度为37摄氏度。进一步的，所述培养环境中CO2浓度为5％。进一步的，所述培养的持续时间是5天。一种H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法，它包括：将病毒样品经终浓度6-12μg/ml的胰酶孵育10-20min后，接种于悬浮MDCK细胞，培养4-6天后，进行HA试验；HA试验中，样品HA效价不低于4log2，则为阳性。如前述的方法，它还包括对病毒类型进行进一步验证，即：当HA试验中样品HA效价不低于4log2时，再将检测HA为阳性的细胞液稀释为2log2单位的抗原进行HI试验；所述HI试验使用的阳性血清包括H9亚型禽流感阳性血清和其他血清；所述其他血清为：鸡新城疫、H5亚型禽流感、H7亚型禽流感和产蛋下降综合征阳性血清中的一种或一种以上；当H9亚新禽流感阳性血清HI效价不低于4log2，且其他血清HI效价低于4log2，则鉴定为H9亚型禽流感。进一步地，前述鉴定方法还包括对病毒类型再次验证，即：当HA试验中样品HA效价不低于4log2时，再使用PCR或DNA测序对细胞液中病毒类型进行验证。如前述的方法，所述培养环境温度为37摄氏度。如前述的方法，所述培养环境中CO2浓度为5％。如前述的方法，所述培养的持续时间是5天。术语“HA试验”指血凝试验，也称为凝集试验；该试验的原理是：病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(HA)。术语“HI试验”指血凝抑制试验，也称凝集抑制试验；该试验的原理是：当病毒悬液中先加入抑制病毒颗粒或血凝素的抗体，红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，此时红细胞凝集现象被抑制，该现象为红细胞凝集抑制(HI)。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的分离方法相比鸡胚分离，病毒分离率更高。进而本专利技术的分离鉴定方法具有更高的灵敏度，能够避免很多漏检情况，更有利于鸡场H9亚型禽流感的防范。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1：MDCK悬浮细胞(培养48h后)；标尺长度为100μm。具体实施方式实施例1本专利技术H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法1.MDCK悬浮细胞的复苏与培养从液氮罐中取出1支细胞，37℃水浴迅速解冻。200g离心5分钟，弃去上清，加入细胞生长液，放置于摇床上，进行悬浮培养，摇床参数：转速为200r/min、温度为37℃、CO2浓度为5％，细胞培养2-3日，细胞密度达到6.0×106/ml后，分装接种于50ml的TPP管中，15ml/管，放置于摇床上，细胞显微镜检如图1所示。2.接毒培养取所需分离病毒的样品，添加终浓度6μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育10min，接种到5管MDCK悬浮细胞，每管接种病毒液0.2ml，放置于摇床上，200r/min、37℃、5％CO2条件下继续培养5日。3.检测3.1HA试验取细胞液，进行HA效价测定，HA效价不低于4log2则判定为病毒分离阳性。3.2HI试验将3.1中检测HA为阳性的细胞液稀释为2log2单位的抗原，利用鸡新城疫、禽流感(H5亚型、H7亚型、H9亚型)和产蛋下降综合征阳性血清进行HI试验。若只有禽流感(H9亚型)阳性血清的有HI效价且不低于4log2，而其他血清HI效价低于4log2，则可初步鉴定为分离出H9亚型禽流感病毒。另外，在事先不知道病毒种类时，也可采用PCR或者测定DNA序列的方法对所分离的病毒进行进一步鉴定。实验例1敏感性检测1.方法使用实施例1的方法，将MDCK复苏培养，当细胞密度达到6.0×106/ml以上时，分装于50mlTPP培养管中，15ml/管。取H9亚型禽流感G株病毒，10倍系列稀释后，取稀释度10-8、10-9、10-10、10-11的病毒液1.0ml，分别添加终浓度为6μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育10min。每个稀释度处理的病毒液，各接种1管MDCK悬浮细胞，每管接种病毒液0.2ml，放置于摇床中，200r/min(摇床转速)、37℃、5％CO2条件下培养5日。取出细胞液，进行HA效价测定，HA效价不低于4log2，判定为病毒分离阳性。2.结果10-8、10-9、10-10稀释组接种MDCK细胞培养5日后，HA效价均不低于4log2，而10-11稀释组HA效价为0，具体结果见表1。表1不同稀释度H9亚型禽流感病毒对MDCK细胞的敏感性试验结果稀释度10-810-910-1010-11HA效价9log2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种H9亚型禽流感病毒分离方法，其特征在于，它包括：/n将病毒样品经终浓度6-12μg/ml的胰酶孵育10-20min后，接种于悬浮MDCK细胞，培养4-6天。/n

【技术特征摘要】
1.一种H9亚型禽流感病毒分离方法，其特征在于，它包括：
将病毒样品经终浓度6-12μg/ml的胰酶孵育10-20min后，接种于悬浮MDCK细胞，培养4-6天。


2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述培养环境温度为37摄氏度。


3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述培养环境中CO2浓度为5％。


4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述培养的持续时间是5天。


5.一种H9亚型禽流感病毒分离鉴定方法，其特征在于，它包括：
将病毒样品经终浓度6-12μg/ml的胰酶孵育10-20min后，接种于悬浮MDCK细胞，培养4-6天后，取细胞液进行HA试验；
HA试验中，样品HA效价不低于4log2，则为阳性。


6.如权利要求5所述的分离鉴定方法，其特征在于：
当HA试验中样品HA效价不低于4log2时...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢刚，李成山，岳丰雄，丁莉，左榕琳，肖倩，王克雄，潘倩，
申请(专利权)人：成都天邦生物制品有限公司，史记生物技术南京有限公司，马鞍山史记动物健康管理有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51