一种全悬浮细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种全悬浮细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗及其制备方法，属于禽病毒疫苗领域。本发明专利技术的方法包括如下步骤：1)使用AGE1细胞悬浮培养新城疫病毒；2)使用MDCK细胞悬浮培养禽流感病毒；3)将步骤1)和步骤2)所得病毒超滤浓缩后灭活，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分制备得到疫苗。本发明专利技术全悬浮细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，能够得到高滴度的病毒；通过本发明专利技术的方法制备得到的二联疫苗，能够产生比鸡胚苗更高的抗体，提供更强的保护。

【技术实现步骤摘要】
一种全悬浮细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗
本专利技术属于禽病毒疫苗领域。
技术介绍
鸡新城疫病毒(NDV)属于副粘病毒科，单股负链RNA病毒。鸡新城疫(ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，致死率极高，给世界各国的养禽业造成了巨大损失。目前，防治ND的主要措施是疫苗接种。禽流感病毒(AIV)在世界各地流行极为广泛，特别是H9亚型AIV，虽然致病力较低，但其引起的继发感染往往给养禽业带来极大的损失，且有资料表明，H9亚型AIV基因可重组到高致病性AIV中，引起高致病性AIV的变异，进而危害家禽甚至人类的健康。所以研制安全高效的H9亚型AIV疫苗是必然选择。现今禽类疫苗主要是用鸡胚生产的,而灭活疫苗是用低免种蛋或非免种蛋生产的，就有可能使疫苗中污染一些垂直传播疾病的病原,致使这些疾病随疫苗的应用而发生传播，大规模生产时还存在鸡胚数量不足等问题。病毒培养直接关系到抗原质量和滴度水平，因此病毒培养技术是影响疫苗质量的重要因素之一。以细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、可以较好的维持病毒抗原稳定等优点。目前，也有部分文献报道采用EB66细胞生产鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗，但是为二阶培养法，即取部分细胞接毒后吸附培养1h，再补加部分病毒生产培养基培养，操作步骤多，耗时长，容易造成污染。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种新的鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗及其制备方法。本专利技术的技术方案包括：一种全悬浮细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，它包括如下步骤：1)使用AGE1细胞悬浮培养新城疫病毒；2)使用MDCK细胞悬浮培养禽流感病毒；3)将步骤1)和步骤2)所得病毒灭活，超滤浓缩后，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分制备得到疫苗。如前述的制备方法，所述步骤3)包括：a.水相制备：将灭活、超滤浓缩后的新城疫病毒和禽流感病毒按1：(0.5-2)的体积比混合，得混合抗原，取混合抗原94-98体积份，加入吐温-802-6体积份，充分搅拌至吐温-80完全溶解，得水相；b.油相制备：取白油92-96体积份，司本-804-8体积份，混匀，得油相；c.乳化：将水相与油相按体积比1：(1.5-2.5)比例，混匀，乳化。如前述的制备方法，所述步骤3)的步骤a中：新城疫病毒和禽流感病毒体积比为1:1；和/或，混合抗原与吐温-80的体积比是96:4。如前述的制备方法，所述步骤3)的步骤b中：白油为94体积份，司本-80为6体积份。如前述的制备方法，所述步骤3)的步骤c中：水相与油相体积比为1:2。如前述的制备方法，所述步骤1)为：将AGE1细胞放大传代至细胞密度为8.0×106/ml以上，接种新城疫病毒，同时添加体积比为10％-20％的无血清DMEM培养基，添加终浓度为10-20μg/ml的胰酶，在33-37℃培养，检测HA效价不低于8log2时，收获病毒液。进一步地，无血清DMEM培养基添加的体积比为15％；进一步地，胰酶终浓度为15μg/ml；进一步地，培养温度为35℃。如前述的制备方法，所述步骤2)为：将MDCK细胞放大传代至细胞密度为6.0×106/ml以上，接种禽流感病毒，同时添加终浓度为8-16μg/ml的胰酶，在35-37℃培养，检测HA效价不低于8log2时，收获毒液。进一步地，所述胰酶的终浓度是12μg/ml。进一步地，培养温度为37℃。前述方法制备得到的鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗。本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术培养病毒的步骤简单，无需二阶培养；2)本专利技术可以得到高滴度的新城疫病毒和禽流感病毒，超过现有技术的水平；3)注射本专利技术的方法制备得到的二联疫苗比注射鸡胚苗能产生更高的抗体，本专利技术的疫苗保护效果更优。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。具体实施方式实施例1本专利技术二联疫苗的制备1病毒在细胞上的增殖1.1鸡新城疫病毒在悬浮细胞上的增殖将AGE1细胞放大传代至7L的生物反应器中，培养液体积为4～5L，pH值设置为7.15，溶氧值设置为60％，转速设置为75r/min，37℃培养。当细胞密度为8.0×106/ml以上时，按0.0001MOI接种新城疫病毒aSG10株病毒，同时添加体积比为15％的无血清DMEM培养基，一次性添加终浓度为15μg/ml的胰酶溶液，将培养温度调至35℃，培养64～80h，取样检测HA效价，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液。共制备3批新城疫病毒，测定其HA效价和病毒含量。结果见表1。表1新城疫病毒在7L生物反应器中的培养1.2禽流感病毒在悬浮细胞上的增殖将MDCK细胞放大传代至7L的生物反应器中，培养液体积为4～5L，pH值设置为7.0，溶氧值设置为50％，转速设置为65r/min，37℃培养。当细胞密度为6.0×106/ml以上时，按0.01MOI接种禽流感G株病毒，一次性添加终浓度为12μg/ml的胰酶溶液，培养42～54h，取样检测HA效价，当HA效价不低于8log2时，收获病毒液。共制备3批禽流感病毒，测定其HA效价和病毒含量。结果见表2。表2禽流感G株病毒在7L生物反应器中的培养2病毒液的浓缩分别将3批NDV和H9AIV病毒液各取3000ml，使用美国PallCorporation超滤系统，选用截留分子量为100KD的超滤膜，浓缩至原体积的1/2。3病毒液的灭活3.1新城疫病毒液的灭活分别将3批2倍浓缩的NDVaSG10株病毒液加入终浓度为0.1％的甲醛，水浴加热至37℃，开始计时，进行37℃恒温灭活20h，每隔2小时摇匀一次，灭活后取病毒液测定其HA效价，并进行灭活检验。灭活后HA效价并未降低，灭活检验结果显示灭活完全。结果详见表3。表3NDVaSG10株病毒液灭活情况3.2禽流感病毒的液灭活分别将3批2倍浓缩的H9AIVG株病毒液加入终浓度为0.2％的甲醛，水浴加热至37℃，开始计时，进行37℃恒温灭活18h，每隔2小时摇匀一次，灭活后取病毒液测定其HA效价，并进行灭活检验。灭活后HA效价并未降低，灭活检验结果显示灭活完全。结果详见表4。表4H9亚型AIVG株病毒液灭活情况4疫苗的配制4.1水相的制备将灭活的3批NDV、AIV两种抗原等体积混合，取混合后的抗原96体积份，加入灭菌冷却后的吐温-804体积份，充分搅拌直至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全悬浮细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：/n1)使用AGE1细胞悬浮培养新城疫病毒；/n2)使用MDCK细胞悬浮培养禽流感病毒；/n3)将步骤1)和步骤2)所得病毒超滤浓缩后灭活，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分制备得到疫苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种全悬浮细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)使用AGE1细胞悬浮培养新城疫病毒；
2)使用MDCK细胞悬浮培养禽流感病毒；
3)将步骤1)和步骤2)所得病毒超滤浓缩后灭活，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分制备得到疫苗。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)包括：
a.水相制备：将灭活、超滤浓缩后的新城疫病毒和禽流感病毒按1：(0.5-2)的体积比混合，得混合抗原，取混合抗原94-98体积份，加入吐温-802-6体积份，充分搅拌至吐温-80完全溶解，得水相；
b.油相制备：取白油92-96体积份，司本-804-8体积份，混匀，得油相；
c.乳化：将水相与油相按体积比1：(1.5-2.5)比例，混匀，乳化。


3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的步骤a中：
新城疫病毒和禽流感病毒体积比为1:1；
和/或，混合抗原与吐温-80的体积比是96:4。


4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的步骤b中：
白油为94体积份，司本-80为6体积份。


5.如权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁莉，刘汉平，李成山，左榕琳，邢刚，岳丰雄，潘倩，何洪奎，肖倩，裴倩如，汪强，
申请(专利权)人：成都天邦生物制品有限公司，史记生物技术南京有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51