一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体地说，涉及一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法。所述的三价流感病毒亚单位疫苗，每剂含H1N1、H3N2和乙B型共三种，所述的三价流感病毒亚单位疫苗为经病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装制备得到的，其中，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活。本发明专利技术方法降低了制得的三价流感病毒亚单位疫苗中游离甲醛的含量，延长了疫苗保存期，升高了疫苗免疫后抗体水平的产生。

【技术实现步骤摘要】
一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法。
技术介绍
流感是由流感病毒引起的，可造成大规模流行的人、禽畜共患的急性呼吸道传播疾病。流行性感冒病毒分甲、乙、丙三型。其中，甲型致病力最强，可感染动物和人类并引起流行甚至是世界范围内的大流行；乙型致病力稍弱，可引起局部流行。流感病毒经常发生抗原漂移和抗原转移，逃避机体免疫系统的防御，这也是造成大流行的原因。流感病毒具有高度传染性，通过飞沫经空气传播。经短暂潜伏期后，急起高热寒战，1-2日内体温可高达40℃，伴随全身乏力、头痛、肌痛、咽痛等症状，可引起肺炎、支气管炎、心肌炎、心包炎等并发症，造成老年人、体弱者等高危人群的大量死亡，给社会带来巨大的损失。市场上现有疫苗为流感全病毒灭活疫苗和流感病毒裂解疫苗，传统裂解疫苗纯化方法为：澄清灭活的单价收获液经超滤浓缩、蔗糖密度区带离心法纯化、超滤除去蔗糖、裂解、再次蔗糖密度区带离心法纯化，再次超滤除去蔗糖，除菌过滤，加入硫柳泵作为防腐剂。工艺复杂，步骤繁琐，消耗大量的人力物力，增加微生物污染风险。同时传统流感疫苗纯度不够且含有对人体有害的佐剂及防腐剂。佐剂虽然可以改善疫苗的免疫应答，但代价是反应原性增加，甚至更严重。例如，老年人接种MF59佐剂流感疫苗后抗体水平提高了，但是接种后的局部反应更多了，在一项老年人的对照研究中，接种含佐剂疫苗的老年人与接种无佐剂的老年人相比，疼痛增加6倍，局部发红增加2倍，乏力和肌肉痛等全身反应也增加了。另据报道，使用了丹麦Statens血清研究所生产的氢氧化铝吸附的百白破疫苗，导致546例注射部位出现顽固性硬结性瘙痒的严重不良反应。其中77％的不良反应病例经皮肤试验确认为对氢氧化铝过敏。目前，国家食品药品管理局已禁止了氢氧化铝佐剂用于狂犬病疫苗的生产。硫柳泵一直被用做许多疫苗的防腐剂，不过现在硫柳泵引起接触性皮炎、变应性结膜炎、耳毒性等毒副作用已经开始引起科研人员的重视，现在已经在美国爱荷华州、加利福尼亚州、英国和其他欧洲国家禁止在儿童疫苗中使用硫柳泵。CN107537030A公开了一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其中，该流感疫苗采用裂解剂和新的纯化方法将裂解后的病毒蛋白进一步纯化，制成三价流感病毒亚单位疫苗，其中每剂含甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)、乙型共三种流感血凝素含量在80％以上，不含佐剂，不含硫柳汞等防腐剂。本专利技术还提供了该流感疫苗的制备方法，包括以下步骤：病毒接种，病毒增殖培养，尿囊液收获，澄清，超滤浓缩，灭活，裂解和超速离心纯化，凝胶过滤层析纯化(超滤)，混配，过滤除菌，分装，包装等步骤。本专利技术提供的流感病毒亚单位疫苗可以提高流感疫苗的安全性，消除了佐剂带来的不良反应，消除了硫柳汞引起的毒副作用。目前，在流感疫苗的生产中，用甲醛作为灭活剂进行病毒的灭活。甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。其既可以作用于病毒含氨基的核苷酸碱基(如A，G，U)，又可作用于病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活。故而为了使病原得到充分的灭活，以免发生散毒事故发生，在疫苗的生产过程中，均采用加大甲醛浓度及延长灭活时间等措施。这样的结果就可能造成在疫苗的保存过程中，多余的游离甲醛醛基不断作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐渐降解，这样疫苗中的有效成分不断流逝，不仅缩短了疫苗的保存期，还降低了疫苗免疫后抗体水平的产生。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种三价流感病毒亚单位疫苗，该疫苗中游离甲醛的含量较少，延长了疫苗的保存期，升高了疫苗免疫后抗体水平的产生。本专利技术的第二目的在于提供所述的三价流感病毒亚单位疫苗的制备方法，该方法在灭活过程中先加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活，采用该方法制得的疫苗中游离甲醛的含量较少，延长了疫苗的保存期，升高了疫苗免疫后抗体水平的产生。为实现本专利技术的第一目的，本专利技术采用如下技术方案：一种三价流感病毒亚单位疫苗，每剂含甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)和乙(B)型共三种，所述的三价流感病毒亚单位疫苗为经病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装制备得到的，其中，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活。目前，在流感疫苗的生产中，用甲醛作为灭活剂进行病毒的灭活。甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。其既可以作用于病毒含氨基的核苷酸碱基(如A，G，U)，又可作用于病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活。故而为了使病原得到充分的灭活，以免发生散毒事故发生，在疫苗生产过程中，均采用加大甲醛浓度及延长灭活时间等措施。这样的结果就可能造成在疫苗的保存过程中，多余的游离甲醛醛基不断作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐渐降解，这样疫苗中的有效成分不断流逝，不仅缩短了疫苗的保存期，还降低了疫苗免疫后抗体水平的产生。本专利技术中，在灭活过程中采用先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活的方法，大大降低了疫苗中游离甲醛的含量，延长了疫苗的保存期，升高了疫苗免疫后抗体水平的产生。进一步的，所述的羧甲基葡聚糖的取代度为0.5-0.7。本专利技术中，所述的羧甲基葡聚糖经羧甲基修饰后，引入了带电的亲水性基团，水溶性增加，取代度越高，水溶性越高，但构象破坏严重，活性下降，适当的取代度可以在不破坏生物活性的基础上增加水溶性，取代度小于0.75才不至于影响免疫活性。本专利技术经试验表明，羧甲基葡聚糖的取代度对所制得的疫苗中游离甲醛的含量有一定的影响。当羧甲基葡聚糖的取代度在0.5-0.7时制得的三价流感病毒亚单位疫苗中游离甲醛的含量明显低于羧甲基葡聚糖的取代度不在0.5-0.7的范围时制得的三价流感病毒亚单位疫苗中游离甲醛的含量。因此，本专利技术中优选所述的羧甲基葡聚糖的取代度为0.5-0.7。为实现本专利技术的第二目的，本专利技术采用如下技术方案：一种所述的三价流感病毒亚单位疫苗的制备方法，包括病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装，其中，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活。进一步的，所述的羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.1-0.5。进一步的，所述的羧甲基葡聚糖的取代度为0.5-0.7。进一步的，所述的羧甲基葡聚糖溶液的浓度为1-5g/100mL。进一步的，所述的羧甲基葡聚糖溶液为将羧甲基葡聚糖加入注射用水中溶解配制而成的。进一步的，所述的甲醛的终浓度为100-150mg/ml，所述的灭活时间为35-4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三价流感病毒亚单位疫苗，每剂含H1N1、H3N2和乙B型共三种，所述的三价流感病毒亚单位疫苗为经病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装制备得到的，其特征在于，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活。/n

【技术特征摘要】
1.一种三价流感病毒亚单位疫苗，每剂含H1N1、H3N2和乙B型共三种，所述的三价流感病毒亚单位疫苗为经病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装制备得到的，其特征在于，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活。


2.根据权利要求1所述的三价流感病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的羧甲基葡聚糖的取代度为0.5-0.7。


3.一种权利要求1或2所述的三价流感病毒亚单位疫苗的制备方法，包括病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装，其特征在于，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的羧甲基葡聚糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：高辉，阮承迈，
申请(专利权)人：中逸安科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12