一种双价支气管炎核酸疫苗、制备方法及用途技术

本发明专利技术提供了一种双价支气管炎核酸疫苗、制备方法及用途，其核心表达区仅为1491bp，序列前引入了分泌信号肽，表达序列引入Kozak序列，并选用含有禽启动子序列质粒，去除了不易成为抗原的疏水区，采用M41和H120特征蛋白拼接，中间连有lingker序列，可刺激产生针对两种毒株的中和抗体，弥补了传染性支气管炎病毒免疫交叉性差的弱点；选用鼠伤寒沙门氏菌作为载体，对宿主本身没有感染隐患，但可支持核酸疫苗长期表达，以达到长期免疫效果；疫苗的免疫方式为经口免疫，可以添加到饲料内，使用方便优于滴鼻或注射免疫方式；该疫苗制备为发酵后收集培养物直接作为疫苗，减少了蛋白纯化，除内毒素等步骤，节约了成本有利于大规模生产。

A bivalent nucleic acid vaccine for bronchitis, its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种双价支气管炎核酸疫苗、制备方法及用途
本专利技术属于动物疫苗抗原制备
，涉及一种双价禽类传染性支气管炎核酸疫苗的制备方法及其免疫用途。
技术介绍
传染性支气管炎(infectiousbronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avianinfectiousbronchitisvirus，IBV)感染引起的一种鸡的急性、高度接触传染性呼吸道传染病。该病毒属于冠状病毒科，冠状病毒属的单股正链RNA病毒，病毒粒子带有囊膜和纤突，含有纤突(S)，膜(M)糖蛋白及内部核衣壳(N)蛋白等三种蛋白，感染后以咳嗽、喷嚏和气管啰音为主要临床表现，可出现产蛋下降，肾病理性肿大，尿酸盐沉积等。其中，雏鸡病死率可达10％～30％，目前临床无有效治疗方式，主要以疫苗预防为主，国内已上市的多为H120和H52鸡胚适应株制备的弱毒苗，而国外多国已分离的毒株多与马萨诸塞株(M41株)相似，已上市了M41株灭活苗，但其受制于流行株多而复杂，各血清型交叉免疫性差等因素的影响，其临床保护效果均非常有限；目前制备疫苗的手段还包括亚单位疫苗或核酸疫苗，但亚单位疫苗需要表达纯化，再进行免疫，具有步骤繁杂，较难去除发酵表达过程中产生的内毒素的问题，现有的核酸疫苗也具有需提纯后再滴鼻免疫以及抗原表达量低，特异性差等缺点，本专利技术由此而来。
技术实现思路
基于当前对寻找预防家禽传染性支气管炎药物的迫切需求，本专利技术为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用了以下技术方案：本专利技术提供了一种双价传染性支气管炎核酸疫苗，其氨基酸序列包含：1)流感病毒血凝素信号肽；2)M41株S1蛋白部分氨基酸序列；3)连接12氨基酸lingker；4)H120株S1蛋白部分氨基酸序列。进一步的，所述核酸疫苗的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。进一步的，所述核酸疫苗的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。进一步的，所述核酸疫苗选用鼠伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50115)作为质粒载体。进一步的，所述核酸疫苗中含有有鸡β-actin启动子的PCAGGS表达质粒。进一步的，所述核酸疫苗表达序列插入到PCAGGS载体的1718bp碱基ECORI酶切位点及1810bp碱基BgiII酶切位点之间位置。进一步的，所述核酸疫苗经过密码子适应性优化后，前端加入了Kozak序列ACCACCATGGCC，核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术提供了一种双价传染性支气管炎核酸疫苗的制备方法，其步骤包括：选定伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50115)做为核酸疫苗质粒载体菌种，接种于培养基中培养，收集菌体沉淀；菌体转入4℃的冷超纯水中，适应30min以上，冷水冲洗3遍，离心，最后用300μl冷超纯水重悬，制备感受态细胞。运用伯乐电转仪，选用板间距为0.2cm电转杯，电转参数设置电压1450V，电激时间2ms，进行电转，电转完成后，所有液体转移人5ml麦康凯液体培养基，37℃，过夜培养。取培养物100μl，涂布在含氨苄西林(100μg/ml)的麦康凯固体平板上37℃培养过夜，挑取阳性菌落，即获得核酸疫苗。本专利技术提供了双价传染性支气管炎核酸疫苗在用于制备对病毒M41毒株及H120毒株有免疫保护作用的制剂中的用途。进一步的，所述制剂为用于预防禽类传染性支气管炎的制剂。本专利技术的积极效果在于：本专利技术提供了一种传染性支气管炎病毒双价核酸疫苗的制备方法，其核酸载体选用鼠伤寒沙门氏菌，其为家禽机体常在菌，对宿主本身没有感染隐患，但其可支持核酸疫苗长期表达，以便达到更好的免疫效果。其制备方式仅为发酵后收集培养物，培养物直接作为疫苗，减少了蛋白纯化，除内毒素等步骤，节约了成本有利于大规模生产。其免疫方式为经口免疫，可以添加到饲料内，使用方便优于滴鼻或注射免疫。该疫苗为提高免疫效果对质粒及核酸做了优化重组，其核心表达区仅为1491bp，利于更高效表达，表达序列前引入了外源分泌信号肽，使抗原更好的释放到细胞外，刺激机体免疫反应，表达序列引入Kozak序列，选用质粒含有禽启动子序列，更高效的表达抗原序列，抗原区去除了不易成为抗原的疏水区，采用M41和H120特征蛋白拼接的形式，中间连有lingker序列，使两种毒株的抗原决定簇都能充分暴露，可刺激产生针对两种毒株的中和抗体，弥补了传染性支气管炎病毒免疫交叉性差的弱点。这些优点都极大的促进了该疫苗的大规模生产及应用。说明书附图图1选取的传染性支气管炎M41毒株S1蛋白257氨基酸片段构象(尾部为防止蛋白缠绕加入的蛋白lingker)；图2选取的传染性支气管炎H120毒株S1蛋白212氨基酸片段构象；图3M120两毒株S1蛋白信号肽分布；图4疫苗合成抗原多肽链结构；图5免疫荧光检测结果。具体实施方式实施例1本专利技术提供了的核酸疫苗，选用鼠伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50115)作为核酸疫苗质粒载体，其优点在于鼠伤寒沙门氏菌经口服免疫后可长期定殖于鸡肝脏等组织，不被清除，这为疫苗提供了长期在体留存途径，其携带的核酸质粒可长期在体内留存并表达抗原，为机体提供长期的抗原刺激，而且该载体疫苗可通过发酵培养获得，与常规的核酸疫苗相比，其省去了质粒提取及除内毒素过程，其免疫也不需要专门的滴鼻操作，而是通过食物添加剂的形式经口免疫，其有利于大规模生产及广泛应用。本方法取鼠伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50115)，涂布营养琼脂平板，37℃过夜培养，挑取单菌落，接入麦康凯液体培养基37℃，摇菌过夜，收集菌体沉淀，随即菌体转入4℃的冷超纯水中，适应30min以上，冷水冲洗3遍，离心，最后用300μl冷超纯水重悬，制备感受态细胞，选用伯乐电转仪，选用板间距为0.2cm电转杯，电转参数设置电压1450V，电激时间2ms，电转完成后，所有液体转移人5ml麦康凯液体培养基，37℃，过夜培养。取培养物100μl，涂在含氨苄西林(100μg/ml)的麦康凯固体平板上37℃培养过夜，挑取阳性菌落，即获得以鼠伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50115)为载体的核酸疫苗。本专利技术提供了一种核酸疫苗的氨基酸序列组成方式。为提高宿主表达效率与适应性本核酸疫苗选用的质粒为带有鸡β-actin启动子的PCAGSS表达质粒。表达达质粒序列结构来自于addgene载体数据库，本核酸疫苗选择核酸片段插入质粒位置为1718bp碱基ECORI酶切位点及1810bp碱基BgiII酶切位点之间。质粒序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并测序。为适应国内传染性支气管炎流行现状，国内主要流行为M41及H120株，本序列选用纤突S蛋白中的S1部分作为抗原基因，因S1蛋白包括大部分的亲水区及小部分的疏水区，本核酸疫苗为利于抗原表达只选用两株毒株的S1蛋白亲水区作为抗原序列，并对序列的密码子进行了适应性优化，为使核酸疫苗具有双价保护效力，本核酸疫苗采用M41及H120两段优化后S1蛋白序列串联后中间加入linker的方式使两个蛋白不相互本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双价传染性支气管炎核酸疫苗，其特征在于其氨基酸序列包含：/n1）流感病毒血凝素信号肽序列；/n2）M41株S1蛋白部分氨基酸序列；/n3）连接12氨基酸lingker；/n4）H120株S1蛋白部分氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种双价传染性支气管炎核酸疫苗，其特征在于其氨基酸序列包含：
1）流感病毒血凝素信号肽序列；
2）M41株S1蛋白部分氨基酸序列；
3）连接12氨基酸lingker；
4）H120株S1蛋白部分氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的双价传染性支气管炎核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.根据权利要求1所述的双价传染性支气管炎核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


4.根据权利要求1所述的双价传染性支气管炎核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗选用鼠伤寒沙门氏菌作为质粒载体。


5.根据权利要求1所述的双价传染性支气管炎核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗中含有有鸡β-actin启动子的PCAGGS表达质粒。


6.根据权利要求1所述的双价传染性支气管炎核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗的表达序列插入到PCAGGS载体的1718bp碱基ECORI酶切位点及1810bp碱基BgiII酶切位点之间位置。


7.根据权利要求6所述的双价传染...

【专利技术属性】
技术研发人员：高江明，徐晓芳，杨萌琳，柳晓春，武娟，陈棽，
申请(专利权)人：徐晓芳，
类型：发明
国别省市：山东;37