一种二联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种二联灭活疫苗，含灭活的猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪肺炎支原体，所述Cap蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述猪肺炎支原体保藏号为：CGMCC No.18879。解决了猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体已知疫苗的毒株地域性、疫苗灭活剂及佐剂等问题。本发明专利技术提供的二联灭活疫苗，含灭活的猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪肺炎支原体，能够提供更简单、有效、低成本的预防和控制猪圆环病毒和猪肺炎支原体感染引起的疾病。

A double inactivated vaccine and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种二联灭活疫苗及其制备方法
本专利技术属于疫苗制备领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎的疫苗。
技术介绍
猪圆环病毒2型（Porcinecircovirstype2，PCV2）是断奶仔猪多系统综合征(Post-weaningMμLtisystemicWastingSyndrome，PMWS)、猪呼吸道病综合征(PorcineRespiratoryDiseasecomplex，PRDC)和猪皮炎和肾病综合征(PorcineDermatitisandNepHropathysyndrome，PDNS)的主要病原之一。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种无囊膜，单链DNA病毒。PCV2主要有PCV2a，PCV2b，PCV2c，PCV2d和PCV2e共5个基因型，近几年，PCV2d变为主要传染的基因型。Cap蛋白由病毒基因组中ORF2开放阅读框编码，是主要的结构蛋白，构成病毒的核衣壳，Cap蛋白是主要的结构蛋白，研究表明其N端含有一个由41个氨基酸残基组成的核定位信号(NLS)，且含有大量的大肠埃希菌稀有密码子，这将严重影响外源蛋白的表达。相关研究证实，Cap蛋白免疫动物可以产生病毒的中和抗体。ORF2基因已经作为研制基因工程疫苗的重点对象。但是，现有技术中Cap蛋白采用真核表达系统产量低，分离纯化困难；而ORF2编码蛋白的N端存在着大量串联或单联的大肠埃希氏菌稀有密码子，严重影响在大肠杆菌中的表达，所以目前报道进行原核表达的多为截短型Cap蛋白，这样虽然蛋白表达量较高，但不是完整的Cap蛋白，不能形成完整的病毒样颗粒，同时一些功能性信号区域和保守序列没能表达。对ORF2基因进行密码子优化，改变了难以在大肠杆菌中表达的稀有密码子，极大地提高了蛋白的表达量，同时表达的完整Cap蛋白氨基酸序列和亲本序列完全一致，没有改变其免疫原性，为保证制备的疫苗免疫效果打下良好的基础。PCV2对猪的致病性主要表现为免疫系统的损伤，可引起淋巴结肿大、淋巴细胞减少等病变，使感染猪处于严重免疫抑制状态，这是PMWS发生的重要原因。猪支原体肺炎（MPS）又称猪喘气病或地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体（Mhp）引起的一种接触性慢性呼吸性传染病。不同年龄不同品种的猪均能感染。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，剖解时以肺部病变为主，出现“肉变样”或“胰变样”等实质性病变。有报道成猪肺炎支原体感染后可引起动物机体免疫抑制，造成其抵抗力下降而招致继发感染。对PCV2而言，它会增加它的病毒载量，病延长病毒在动物体内存在的时间，协同其促进肺部和淋巴病变，从而提高PMWS的发生率。临床调查显示，猪圆环病毒和猪支原体肺炎的混合感染极为广泛，发病率严重，给养猪业造成了严重的经济损失。疫苗接种是防治猪圆环病毒和猪支原体肺炎的重要方法。为了更简单、有效、降低成本的预防和控制猪圆环病毒和猪肺炎支原体感染引起的疾病，我们研制了猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗（BL21/pET30a-ORF2株+Q株），研究其安全性与有效性指标。
技术实现思路
针对猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体已知疫苗的毒株地域性、疫苗灭活剂及佐剂等问题，本专利技术提供一种预防猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎有效的疫苗，本专利技术的疫苗在受试者中诱导针对猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体攻击的保护性免疫应答。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种二联灭活疫苗，含灭活的猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪肺炎支原体，所述Cap蛋白编码基因序列如SEQIDNO.1所示，所述猪肺炎支原体保藏号为：CGMCCNo.18879。一种上述二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）将含有SEQIDNO.1序列的载体转化大肠杆菌得到重组菌，诱导表达获得Cap蛋白，灭活后作为疫苗抗原A；（2）将猪肺炎支原体灭活，制备成疫苗抗原B；（3）将疫苗抗原A和疫苗抗原B混合搅拌，再与佐剂混合获得疫苗。所述二联灭活疫苗，含Cap蛋白≥100μg/mL，猪肺炎支原体≥5×108CCU/mL。所述佐剂为ISA系列佐剂，优选ISA15AVG。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的二联灭活疫苗，含灭活的猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪肺炎支原体，能够提供更简单、有效、低成本的预防和控制猪圆环病毒和猪肺炎支原体感染引起的疾病。生物保藏信息猪肺炎支原体，保藏编号为CGMCCNo.18879，保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：中国北京北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年12月12日。附图说明图1：PCV2ORF2基因PCR检测结果，其中，M:DL2000DNAMarker，1:阴性对照，2:阳性质粒扩增结果；图2：Cap蛋白SDS-PAGE电泳检测结果，M:蛋白Marker，1:诱导前菌液检测结果，2:诱导后裂解上清检测结果；图3：Cap蛋白Western-blot电泳检测结果。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗的制备1.疫苗用Cap蛋白的获得1.1重组表达载体pET30a-ORF2的构建与诱导表达1.1.1ORF2基因的获得与密码子优化将临床分离疑似PMWS病理材料处理后接种无PCV2污染的PK-15细胞，盲传三代后，PCR扩增猪圆环病毒2型全基因组，并进行病毒的分离鉴定。引物序列如下：上游引物序列如下：P1：5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’下游引物序列如下：P2：5’-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’对全基因组扩增产物测序。将全基因组序列登陆GenBank（No.DQ346683）。对该病毒ORF2基因进行优化，改造为大肠杆菌嗜好的密码子，能更高效表达Cap蛋白，表达率达90%以上。序列如SEQIDNO.1所示。将优化改造后的ORF2基因5’端和3’端分别加入BamHI和XhoI限制性内切酶酶切位点，进行人工合成。1.1.2重组表达载体pET30a-ORF2的构建将合成的重组ORF2基因双酶切后与pET30a原核表达载体的相应酶切位点连接，构建pET30a-ORF2表达载体。用热应激法将连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃培养。挑取单菌落，在含有卡那霉素的LB培养基中培养，碱裂解法提取质粒，经PCR扩增和BamHI、XhoI双酶切鉴定，阳性质粒获得目的条带，将阳性质粒进行测序，测序结果证明优化后的ORF2基因已经成功插入到pET30a质粒中，没有点突变，原核表达载体构建成功，将测序正确的重组质粒命名为pET30a-ORF2。1.1.3重组表达载体pET30a-ORF2的PCR根据改造后的ORF2基因序列，设计一对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二联灭活疫苗，其特征在于，含灭活的猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪肺炎支原体，所述Cap蛋白编码基因序列如SEQ ID NO. 1所示，所述猪肺炎支原体保藏号为：CGMCC No.18879。/n

【技术特征摘要】
1.一种二联灭活疫苗，其特征在于，含灭活的猪圆环病毒2型Cap蛋白和猪肺炎支原体，所述Cap蛋白编码基因序列如SEQIDNO.1所示，所述猪肺炎支原体保藏号为：CGMCCNo.18879。


2.一种如权利要求1所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含有SEQIDNO.1序列的载体转化大肠杆菌得到重组菌，诱导表达获得Cap蛋白，灭活后作为疫苗抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，吴晓燕，时建立，彭喆，徐绍建，王硕，李琛，刘畅，韩红，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37