猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗极其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。本发明专利技术由抗原和疫苗佐剂构成；所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原组成；所述猪圆环病毒2型抗原为毕赤酵母表达获得的cap蛋白，蛋白含量≥150μg/mL；所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体菌液；所述副猪嗜血杆菌为灭活的副猪嗜血杆菌菌液；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。本发明专利技术提供的猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，在预防此三种猪病，提高猪生产性能表现出明显优势。

Inactivated vaccine of porcine circovirus type 2, Mycoplasma hyopneumoniae and Haemophilus parasuis and its preparation

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型引起的猪的一种传染病，引起仔猪断奶综合征、猪皮炎与肾病综合征及母猪繁殖障碍，其临床表现多样化。猪感染圆环病毒后，可引起严重的免疫抑制，从而继发或并发其他传染病，如猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、猪溶血性链球菌等疾病。猪支原体肺炎，又称猪地方性流行肺炎，是由猪肺炎支原体引起的以慢性、高度传染性、高发病率和低死亡率为主要特点的呼吸道疾病。感染猪长期发育不良、饲料转化率低、日增重下降，严重影响养猪业的经济效益。猪肺炎支原体和其他呼吸道疾病的病原，如猪繁殖与呼吸道综合征病毒、放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪流感病毒、圆环病毒2型混合感染时，会使病情加剧，引起猪的死亡。猪支原体肺炎是一种顽固性慢性病，抗支原体药物治疗一般可以抑制该病但很难清除，用药后咳喘症状消失，但停药后容易再次复发。副猪嗜血杆菌定居于健康猪的上呼吸道，是猪上呼吸道的一种共栖菌。在转群、断奶后失去母源抗体保护、其他疾病导致免疫力下降时，表现出浆膜炎、脑膜炎等症状，可影响2周龄的哺乳仔猪和4个月的青年猪，主要在断奶后和保育期发病，多见于5-8周龄的猪。猪圆环和猪肺炎支原体属于免疫抑制病，导致猪群免疫力下降，给副猪嗜血杆菌的致病创造条件，这三种疾病常发生混感，造成猪只的发病及死亡，严重影响我国养猪事业的发展。目前，市售疫苗中仅有相关单苗或者二联疫苗，免疫频率过大，导致猪只应激。同时由于抗生素滥用，导致耐药菌株的出现，使药物治疗趋于无效；本专利技术所提供的猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联疫苗，可做到一针三防，减少免疫次数及应激，切实解决养猪业的难题。虽然也有关于圆环病毒2型亚单位疫苗的联苗专利技术专利，但圆环病毒2型Cap蛋白采用大肠杆菌表达系统获得。大肠杆菌表达系统为原核表达系统，缺乏对蛋白翻译后的加工修饰作用，因此不能对表达获得的圆环cap蛋白进行空间构型的折叠修饰，很难保证后期cap蛋白的VLP有100％活性。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术提供了一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的制备方法。本专利技术的技术方案为：一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，由抗原和疫苗佐剂构成；所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原组成；所述猪圆环病毒2型抗原为毕赤酵母表达并纯化获得的cap蛋白，蛋白含量≥150μg/mL；所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体破碎菌液；所述副猪嗜血杆菌为灭活的副猪嗜血杆菌破碎菌液；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。毕赤酵母表达系统为真核表达系统，可以对表达蛋白进行后期的加工修饰，使目的蛋白更接近天然的空间构想，蛋白活性更好。本专利技术的三联灭活疫苗中，猪圆环病毒2型抗原为毕赤酵母表达并纯化的cap蛋白，该cap蛋白活性高，免疫效果好。作为优选方案，所述水性高分子聚合物佐剂为MontanideGel。作为优选方案，所述复合多糖类免疫增强剂为中药多糖水溶性复合物。水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂即构成本专利技术疫苗的佐剂MontanideGel-Max。作为优选方案，灭活的猪肺炎支原体破碎菌液，灭活前活菌数量不低于109CCU/mL。作为优选方案，灭活的副猪嗜血杆菌破碎菌液，灭活前活菌数不低于2.5×109CCU/mL。所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的制备方法，包括步骤：1)采用灭菌的FBSM无机盐培养基培养毕赤酵母，甲醇诱导表达猪圆环病毒2型cap蛋白；利用发酵罐分别培养猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌；2)分别灭活圆环cap蛋白浓缩纯化液和猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌浓缩液；3)制备油相，将水性高分子聚合物佐剂灭菌备用；4)制备水相，将复合多糖类免疫增强剂采用PBS溶液溶解，过滤除菌后后，加入经毕赤酵母表达获得且纯化的cap蛋白、灭活的猪肺炎支原体破碎液；5)将步骤4)获得的水相置于乳化罐，搅拌下缓慢加入步骤3)制得的油相，搅拌均匀；6)加入灭活的副猪嗜血杆菌菌液，搅拌均匀；7)加入硫柳汞溶液，搅拌均匀，得所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗。作为优选方案，猪圆环病毒2型抗原的制备方法为：①将毕赤酵母细胞接种于培养基中进行种子培养；增殖后的种子液接种于发酵培养基中发酵；当菌液OD600为1.0时，加入甲醇诱导，收获菌液；②酵母收获液经连续流离心去除上清，沉淀用0.01MPBS溶液重悬后破碎处理；破碎液经离心去除沉淀，收获上清；③上清液经300KD超滤浓缩，获得猪圆环病毒2型抗原cap蛋白浓缩液；④cap蛋白浓缩液经灭活处理，利用柱层析进行纯化。作为优选方案，获取猪肺炎支原体抗原的方法为：A)将猪肺炎支原体接种于支原体液体培养基中，待培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH下降至6.8时收获猪肺炎支原体菌液；B)超滤浓缩猪肺炎支原体收获液，使得猪肺炎支原体活菌数达到1012-1013CCU/ml，加入原液体积1/2的0.01M的PBS缓冲液再次超滤，去除上清，菌体沉淀破碎处理，最后用0.01M的PBS重悬至原体积的1％；C)将已浓缩的猪肺炎支原体破碎若干次，然后进行灭活处理。作为优选方案，获取副猪嗜血杆菌抗原的方法为：a)将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型、5型种子按1％量接种于TSB液体培养基，发酵罐中37℃，250转/分，培养16-18h，收获菌液；b)采用切向流超滤菌体发酵液；菌体沉淀用等体积的含1％A试剂的0.01M的PBS溶液重悬，再次超滤去除上清，最后用PBS溶液重悬计数；c)对超滤浓缩收获的菌体进行灭活处理。作为优选方案，所述灭活处理加入终浓度为0.4％的甲醛溶液，置于2-8℃灭活处理24h，期间每隔2h摇匀一次。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，在预防此三种猪病，提高猪生产性能表现出明显优势。安全性试验表明，倍量及超量腹腔注射豚鼠后，连续观察一周，豚鼠精神状态良好，无死亡；超量免疫试验猪后，精神状态良好，无呕吐、注射部位红肿等异常临床反应。效力试验显示，免疫猪三联疫苗后，圆环抗体水平、支原体抗体水平及副猪嗜血杆菌抗体水平均能达到单苗水平，相互之间抗原组分无干扰。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，由抗原和疫苗佐剂构成；其特征在于：所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原组成；所述猪圆环病毒2型抗原为毕赤酵母表达并纯化获得的cap蛋白，蛋白含量≥150μg/mL；所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体破碎菌液；所述副猪嗜血杆菌为灭活的副猪嗜血杆菌破碎菌液；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，由抗原和疫苗佐剂构成；其特征在于：所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原组成；所述猪圆环病毒2型抗原为毕赤酵母表达并纯化获得的cap蛋白，蛋白含量≥150μg/mL；所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体破碎菌液；所述副猪嗜血杆菌为灭活的副猪嗜血杆菌破碎菌液；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。


2.如权利要求1所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于：所述水性高分子聚合物佐剂为MontanideGel。


3.如权利要求1或2所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于：所述复合多糖类免疫增强剂为中药多糖水溶性复合物。


4.如权利要求1所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于：灭活的猪肺炎支原体破碎菌液，灭活前活菌数量不低于109CCU/mL。


5.如权利要求1所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，其特征在于：灭活的副猪嗜血杆菌破碎菌液，灭活前活菌数不低于2.5×109CCU/mL。


6.如权利要求1所述猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤：
1）采用灭菌的FBSM无机盐培养基培养毕赤酵母，甲醇诱导表达猪圆环病毒2型cap蛋白；利用发酵罐分别培养猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌；
2）分别灭活圆环cap蛋白浓缩纯化液和猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌浓缩液；
3）制备油相，将水性高分子聚合物佐剂灭菌备用；
4）制备水相，将复合多糖类免疫增强剂采用PBS溶液溶解，过滤除菌后后，加入经毕赤酵母表达获得且纯化的cap蛋白、灭活的猪肺炎支原体破碎液；
5）将步骤4）获得的水相置于乳化罐，搅拌下缓慢加入步骤3）制得的油相，搅拌均匀；
6）加入灭活的副猪嗜血杆菌菌液，搅拌均匀；
7）加入硫柳汞溶液，搅拌均匀，得所述猪圆环病毒2型、...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿兴良，王楠，朱杰，徐海军，杨合涛，杨灵芝，
申请(专利权)人：山东滨州沃华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37