表达猪蓝耳病毒GP5蛋白的重组杆状病毒的构建方法技术

本发明专利技术涉及兽用生物制品领域，特别公开了一种表达猪蓝耳病毒GP5蛋白的重组杆状病毒的构建方法。本发明专利技术根据Genbank蓝耳病毒CH

【技术实现步骤摘要】
表达猪蓝耳病毒GP5蛋白的重组杆状病毒的构建方法


[0001]本专利技术涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种表达猪蓝耳病毒GP5蛋白的重组杆状病毒的构建方法。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV )引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征的一种高度接触性传染病。目前该病在我国广泛流行，以母猪流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎，以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征，其发病率高、病死率高、治愈率低，给我国的养猪业造成严重的经济损失。
[0003]PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组不分节段，全长约15kb，呈球形或卵圆形，直径为45
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65nm,呈20面体对称。PRRSV基因组含有9个开放阅读框，分别命名为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3
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ORF7。其中，ORF2a、ORF2b、ORF3
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ORF7编码结构蛋白，编码的相应结构蛋白依次为GP2、E、GP3、GP4、GP5、基质蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）,GP5、M和N是主要的结构蛋白。GP5蛋白是重要的囊膜糖蛋白，分子量为24
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26kd，含有4个糖基化位点。该蛋白含有一段较大的内部疏水结构域，与膜的锚定作用相关，同时，GP5蛋白是不同毒株间变异最大的蛋白，既有线性表位，又有构象表位，能诱导产生中和抗体，是PRRSV主要的免疫原性蛋白。
[0004]目前，PRRS的防控主要以免疫预防为主，在我国主要以疫苗免疫为主，常用的疫苗有弱毒活疫苗和灭活疫苗两大类。弱毒活疫苗免疫力较强，产生抗体快，用量少，成本低，但存在散毒及毒力返强的风险。灭活疫苗具有安全性好，诱导产生抗体时间长，但注射剂量高，成本高。因此亚单位疫苗的研究成为焦点。由于GP5蛋白含有多个糖基化位点，采用原核表达时容易导致蛋白活性低。杆状病毒表达为真核表达系统，可对目的蛋白进行加工修饰，更好的保持目的蛋白的生物活性，因此本研究采用杆状病毒表达系统制备GP5蛋白。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种路径简洁、免疫反应性好的表达猪蓝耳病毒GP5蛋白的重组杆状病毒的构建方法。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种表达猪蓝耳病毒GP5蛋白的重组杆状病毒的构建方法，包括如下步骤：（1）GP5基因的扩增及重组供体质粒的构建：根据PRRSV CH
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1a株的基因序列，运用生物信息学软件设计引物，扩增获得ORF5目的基因；使用通用引物鉴定重组杆粒；以PRRSV CH
‑
1a株基因组为模板，扩增GP5基因，回收纯化目的条带；将目的片段与转移载体pFastBac
TM
Dual分别进行 BamH I和Sal I双酶切，回收纯化后进行连接，化学法转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组供体质粒pFBD
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GP5，并进行酶切测序鉴定；
（2）GP5重组穿梭质粒的构建与鉴定：将供体质粒pFBD
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GP5转化至含有AcBacmid和Helper质粒的DH10Bac感受态细胞，平板上培养后筛选，选取白色单菌落；抽提DNA，以M13通用引物进行PCR检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为rBacmid GP5，并提取rBacmid
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GP5重组杆粒，用于细胞转染；（3）GP5重组杆状病毒的获得与鉴定：采用脂质体转染试剂盒，将rBacmid
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GP5转染生长状态良好的Sf9昆虫细胞，培养待出现细胞病变后，收集上清液作为P0代重组病毒；将细胞上清液在Sf9昆虫细胞传3代，收集第3代细胞上清液，提取病毒DNA为模板，以扩增GP5基因的引物F、R进行PCR检测，筛选获得阳性重组病毒命名为rBac
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GP5；（4）GP5蛋白的Western
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blot鉴定：将重组病毒rBac
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GP5接种Sf9昆虫细胞，感染后离心收集细胞沉淀；用细胞裂解液PMSF裂解细胞并做超声处理，离心收集上清液，用于Western
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blot分析；（5）GP5蛋白的免疫荧光鉴定：将重组病毒rBac
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GP5接种于Sf9昆虫细胞，感染后用PBS洗涤，用甲醇固定后PBS洗涤；在使用NBS封闭，以PBS稀释PRRSV阳性血清为一抗，孵育后用PBST洗涤；以NBS稀释Anti
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Swine IgG(H+L)为二抗，孵育后用PBST洗涤，置于荧光倒置显微镜下观察结果，处理Sf9细胞为阴性对照。
[0007]本专利技术根据Genbank蓝耳病毒CH
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1a株ORF5基因序列，设计合成引物，扩增ORF5基因片段，以pFastBac
TM
Dual质粒为骨架，将ORF5基因插入该质粒，获得一种杆状病毒转移载体pFBD
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GP5，转化至DH10Bac感受态细胞，获得重组杆粒rBacmidGP5；转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒。经鉴定，重组杆状病毒可在昆虫细胞中高效表达GP5蛋白，且该蛋白具有良好生物学活性和免疫原性。
[0008]本专利技术上述构建方法还包括步骤（6）GP5蛋白免疫原性鉴定：将重组病毒rBac
‑
GP5接种Sf9昆虫细胞，感染后离心收集细胞沉淀；用细胞裂解液PMSF裂解细胞并做超声处理，离心收集蛋白上清液；蛋白上清液经柱层析工艺纯化，与水包油包水佐剂混合制备疫苗，免疫14
‑
21日龄仔猪，分别在免后14d、28d、56d采血，检测GP5抗体。
[0009]进一步优选的，步骤（1）中，上游引物F:5
’‑
CGGATCCATGTTGGGGAAATGCTTGACC
‑3’
；下游引物R：5
’‑
GCGTCGACCTAGAGACGACCCCATTGTT
‑3’
；通用引物M13 F：5
’‑
CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG
‑3’
；M13 R：5
’‑
AGCGGATAACAATTTCACACAGG
‑3’
。
[0010]进一步优选的，步骤（2）中，在含有卡那霉素50μg/mL、庆大霉素7μg/mL、四环素10μg/mL、X
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gal 100μg/mL和IPTG 40μg/mL的LB平板上培养48h，两轮蓝白斑筛选，选取白色单菌落。
[0011]进一步优选的，步骤（3）中，转染的昆虫细胞于28℃恒温培养箱中培养36
‑
72h，待出现细胞病变后，收集上清液作为P0代重组病毒。
[0012]进一步优选的，步骤（4）中，Sf9昆虫细胞感染72本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达猪蓝耳病毒GP5蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其特征为，包括如下步骤：（1）GP5基因的扩增及重组供体质粒的构建：根据PRRSV CH
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1a株的基因序列，运用生物信息学软件设计引物，扩增获得ORF5目的基因；使用通用引物鉴定重组杆粒；以PRRSV CH
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1a株基因组为模板，扩增GP5基因，回收纯化目的条带；将目的片段与转移载体pFastBac
TM
Dual分别进行 BamH I和Sal I双酶切，回收纯化后进行连接，化学法转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组供体质粒pFBD
‑
GP5，并进行酶切测序鉴定；（2）GP5重组穿梭质粒的构建与鉴定：将供体质粒pFBD
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GP5转化至含有AcBacmid和Helper质粒的DH10Bac感受态细胞，平板上培养后筛选，选取白色单菌落；抽提DNA，以M13通用引物进行PCR检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为rBacmid GP5，并提取rBacmid
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GP5重组杆粒，用于细胞转染；（3）GP5重组杆状病毒的获得与鉴定：采用脂质体转染试剂盒，将rBacmid
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GP5转染生长状态良好的Sf9昆虫细胞，培养待出现细胞病变后，收集上清液作为P0代重组病毒；将细胞上清液在Sf9昆虫细胞传3代，收集第3代细胞上清液，提取病毒DNA为模板，以扩增GP5基因的引物F、R进行PCR检测，筛选获得阳性重组病毒命名为rBac
‑
GP5；（4）GP5蛋白的Western
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blot鉴定：将重组病毒rBac
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GP5接种Sf9昆虫细胞，感染后离心收集细胞沉淀；用细胞裂解液PMSF裂解细胞并做超声处理，离心收集上清液，用于Western
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blot分析；（5）GP5蛋白的免疫荧光鉴定：将重组病毒rBac
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GP5接种于Sf9昆虫细胞，感染后用PBS洗涤，用甲醇固定后PBS洗涤；在使用NBS封闭，以PBS稀释PRRSV阳性血清为一抗，孵育后用PBST洗涤；以NBS稀释Anti
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Swine IgG(H+L)为二抗，孵育后用PBST洗涤，置于荧光倒置显微镜下观察结果，处理Sf9细胞为阴性对照。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：还包括步骤（6）GP5蛋白免疫原性鉴定：将重组病毒rBac
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GP5接种Sf9昆虫细胞，感染后离心收集细胞沉淀；用细胞裂解液PMSF裂解细胞并做超声处理，离心收集蛋白上清液；蛋白上清液经柱层析工艺纯化，与水包油包水佐...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿兴良，朱杰，杨灵芝，杨平，翟庆贺，吴洪才，
申请(专利权)人：山东滨州沃华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：