一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法技术

本发明专利技术属于生物工程的技术领域，具体涉及一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法。所述的转染试剂为一种两亲性聚合物，其为以疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的聚乙烯亚胺衍生。本发明专利技术所提供的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，通过疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的得到，原料成本低廉，制备方法简单。本发明专利技术所提供的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染方法，省去了在细胞内进行病毒包装、筛选的步骤，简化了原有的实验流程，提高了工作效率，节约了经济成本，为昆虫杆状病毒表达载体在柞蚕体内进行蛋白表达的研究奠定了基础，也为杆状病毒在昆虫中的应用指明了一条新的方向。病毒在昆虫中的应用指明了一条新的方向。病毒在昆虫中的应用指明了一条新的方向。

【技术实现步骤摘要】
一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法


[0001]本专利技术属于生物工程的
，具体涉及一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法。

技术介绍

[0002]杆状病毒(Baculovirus)由壳、内核和壳外包膜结构组成，形态为杆状。杆状病毒主要是鳞翅目昆虫的病原体，同时也感染膜翅目，双翅目，鞘翅目和毛鳞翅目等节肢动物。杆状病毒根据形态和结构被分为三个属：核型多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus，NPVs)，颗粒性病毒(Granulosis Virus，GVs)，非封闭杆状病毒(Nonoccluded Baculoviruses，NOBs)。野生核型多角体病毒被29kDa多角体蛋白包被，形成多角体结构。多角体非常稳定，能长久保存在植物表面和土壤中。但受到鳞翅目昆虫中肠的高pH>10影响时，会溶解并释放出感染性病毒粒子，从而感染宿主。核型多角体病毒由于容易获得，因此得到广泛研究和应用。
[0003]核型多角体病毒(NPV)在感染晚期大量表达多角体蛋白，杆状病毒表达载体系统利用这一特征，通过强多角体蛋白启动子来驱动外源基因的表达。随着基因工程技术的发展，核型多角体病毒表达载体系统的构建越来越完善，目前已和酵母、大肠杆菌和哺乳动物并称为四大表达系统。
[0004]柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pemyi NuclearpolyhedrosisVirus，ApNPV)是危害柞蚕的主要病原体之一，具有高度的特异性。随着基因工程的发展，柞蚕核型多角体表达系统日益完善，利用该系统已成功表达绿色荧光蛋白和人生长激素等多种蛋白。柞蚕蛹作为表达蛋白的宿主，个体大，具有滞育的特性，使其更易于长期保存。Bac
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to
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Bac技术的产生极大提高了构建柞蚕核型多角体重组病毒的效率，缩短了表达外源蛋白周期，对工业化生产有很大意义。
[0005]目前在利用ApNPV于柞蚕蛹体内进行蛋白表达的过程中，需要经过基因克隆、构建载体、细胞转染、重组病毒包装与筛选、外源蛋白表达等步骤。其中细胞转染、重组病毒包装与筛选不仅是此过程的重点，也是难点。原因主要有：
[0006]1、由于柞蚕核型多角体病毒的寄主专一性，目前还没有发现对该病毒特别敏感的细胞用来进行转染、形成病毒包装等实验。
[0007]2、转染实践中，昆虫细胞培养条件非常复杂、成本也特别昂贵。
[0008]3、目前的Tn5细胞虽然能够被柞蚕核型多角体病毒感染，但转染效率普遍较低，操作也特别复杂，且重组病毒感染柞蚕时病毒活性较低。
[0009]综上，如何解决在柞蚕蛹体内进行蛋白表达过程中获得重组病毒是本领域急需解决的问题。

技术实现思路

[0010]鉴于此，本专利技术提供了一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法。该方法通过以疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰所得到的两亲性共聚物为转染试剂，将柞蚕核型多角体重组病毒杆粒DNA与转染试剂混合，直接注入柞蚕蛹体内进行体内转染获得重组杆状病毒，进而表达外源蛋白，从而跳过转染细胞进行病毒包装这个步骤。该方法不仅解决了细胞转染过程中的难点，同时简化了实验流程，提高了工作效率，节约了经济成本，为昆虫杆状病毒表达载体在柞蚕体内进行蛋白表达的研究奠定了基础。
[0011]第一方面，本专利技术提供一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，所述的转染试剂为一种两亲性聚合物，其为以疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的聚乙烯亚胺衍生物，结构如下式I所示：
[0012][0013]式中R代表疏水性化合物，n代表不同分子量的聚乙烯亚胺。
[0014]本专利技术的实施方案中，所述的疏水性化合物选自胆酸、油酸、聚乳酸
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羟基乙酸共聚物和脂肪酸。
[0015]本专利技术的实施方案中，所述的聚乙烯亚胺的分子量为1800
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50000，所述聚乙烯亚胺为线性聚乙烯亚胺或支化聚乙烯亚胺。
[0016]本专利技术一个优选的实施方案中，所述的转染试剂为以聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物对支化聚乙烯亚胺进行疏水修饰所得到，其中聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物结构如下式II所示。
[0017][0018]式中x，y代表聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的摩尔比不同，作为优选，乳酸与羟基乙酸的摩尔比为50：50。
[0019]第二方面，本专利技术提供了上述的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0020](1)将疏水性化合物溶于无水N，N
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二甲基甲酰胺(DMF)中，终浓度为10～100mg/
ml，在反应液中加入N
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羟基丁二酰亚胺(NHS)与二环己基碳二亚胺(DCC)，两者的终浓度分别为1～10mg/ml与2～20mg/ml，搅拌3
‑
5h使其充分溶解。
[0021](2)将聚乙烯亚胺溶于无水DMF中，搅拌1
‑
2h，终浓度为10～100mg/ml。
[0022](3)用0.45μm的滤膜过滤步骤1)中获得的疏水性化合物溶液，除去反应生成的杂质，将过滤后的溶液滴加到和步骤2)中获得的聚乙烯亚胺溶液中，室温搅拌24
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48h。
[0023](4)将步骤3)中反应后的溶液用8000
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14000的透析袋透析48
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72h，除去DMF溶剂，将透析后的溶液过0.45μm的滤膜除去未反应的疏水性化合物。
[0024](5)将步骤4)中过滤后的溶液进行冷冻干燥，得到转染试剂，将转染试剂置于
‑
20℃存储备用。
[0025]第三方面，本专利技术提供一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染方法，其包括以下步骤：
[0026](1)分别准备DNA、待转染宿主柞蚕蛹，其中DNA为柞蚕核型多角体重组病毒杆粒DNA，待转染宿主柞蚕蛹为滞育柞蚕蛹。
[0027](2)将步骤1)中准备的DNA缓慢加入转染试剂中，混匀后37℃孵育30min，得到转染试剂与DNA复合物。
[0028](3)将转染试剂与DNA复合物注射到柞蚕蛹体内。
[0029]所述步骤2)中转染试剂与DNA溶液的质量比为0.1～20，DNA加入转染试剂中使DNA的终浓度为0.1
‑
0.3mg/ml。
[0030]所述步骤3)中每只柞蚕蛹的转染试剂与DNA复合物注射量为50～150μl。
[0031]本专利技术与现有技术相比具有如下优点：
[0032]本专利技术所提供的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，通过疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的得到，原料成本低廉，制备方法简单。
[0033]本专利技术所提供的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染方法，省去了在细胞内进行病毒包装、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，其特征在于，所述的转染试剂为两亲性聚合物，其为以疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的聚乙烯亚胺衍生物，结构如下式I所示：式中R代表疏水性化合物，n代表不同分子量的聚乙烯亚胺。2.根据权利要求1所述的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，其特征在于，所述的疏水性化合物选自胆酸、油酸、聚乳酸
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羟基乙酸共聚物和脂肪酸。3.根据权利要求1或2所述的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺的分子量为1800
‑
50000；所述聚乙烯亚胺为线性聚乙烯亚胺或支化聚乙烯亚胺。4.根据权利要求3所述的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，其特征在于，所述的转染试剂为以聚乳酸
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羟基乙酸共聚物对支化聚乙烯亚胺进行疏水修饰所得到，其中聚乳酸
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羟基乙酸共聚物结构如下式II所示，式中x，y代表聚乳酸
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羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的不同摩尔比。5.根据权利要求4所述的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，其特征在于，乳酸与羟基乙酸的摩尔比为50：50。6.一种制备如权利要求1至5中任一项所述的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂的方法，其特征在于，其包括以下步骤：(1)将疏水性化合物溶于无水N，N
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二甲基甲酰胺中，终浓度为10～100mg/ml，在反应液中加入N
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羟基丁二酰亚胺与二环己基碳二亚胺，使两者的终浓度分别为1～10mg/ml与2～20mg/ml，搅拌3
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5h充分溶解；(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文利，古苏云，刘宇博，张嘉宁，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：