新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用技术

新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于四联疫苗研发领域，制备方法包括：目的基因的优化及合成、重组穿梭质粒的构建、重组杆粒的构建、重组杆状病毒的拯救、嵌合病毒样颗粒的制备及纯化，最终获得嵌合病毒样颗粒NDV

【技术实现步骤摘要】
新流法腺四联病毒样颗粒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于四联疫苗研发
，具体涉及一种新流法腺四联病毒样颗 粒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]新城疫(Newcastle disease，ND)、禽流感(Avine influenza，AI)、传染性 法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)和禽4型腺病毒病(Fowl adenovirus， FAd)是目前危害国内家禽养殖业的主要动物疫病，造成的经济损失非常严重。 根据近期分子流行病学调查数据报道，新城疫在我国的主要流行毒株为基因V II 型，而主要疫苗株为基因II型LaSota弱毒株，基因型的不匹配和活疫苗的不安 全性导致新城疫的净化困难重重。禽流感血清学调查结果表明H9N2亚型分离 率位于AIV各亚型之首，自2003年起农业部指定研制并批准了禽流感灭活疫苗 (如H9亚型：SS株)，但灭活疫苗存在免疫原性不足和无法有效区分疫苗抗体 与野毒感染抗体等局限性。传染性法氏囊病疫苗大多基于经典毒株研制的，对 临床流行的超强毒株或变异株感染的鸡不能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.新流法腺四联病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、目的基因的优化及合成根据昆虫细胞密码子偏好性对NDVNA
‑
1株的M基因和F基因、H9N2AIV株的HA基因、IBD SH99株的VP2基因、HB 1510株的Fiber
‑
2基因进行密码子优化；M基因优化后序列如SEQ ID NO.1所示；F基因优化后序列如SEQ ID NO.2所示；HA基因优化后序列如SEQ ID NO.3所示；VP2基因优化后序列如SEQ ID NO.4所示；Fiber
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2基因优化后序列如SEQ ID NO.5所示；步骤二、重组穿梭质粒的构建根据各基因优化后序列和pFastbac
‑
1载体信息设计特异性引物和M13鉴定引物，利用PCR进行基因扩增及鉴定，将合成的各个质粒分别进行双酶切并利用胶回收试剂盒回收目的片段，将各目的片段分别连接至pFastbac1载体，转化至Escherichia coli DH5α感受态细胞中进行PCR及双酶切筛选，最终获得重组穿梭质粒pFastbac1
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M、pFastbac1
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F、pFastbac1
‑
GPI
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HA、pFastbac1
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GPI
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VP2和pFastbac1
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GPI
‑
Fiber
‑
2；步骤三、重组杆粒的构建将步骤二构建的各重组穿梭质粒分别转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中进行同源重组，涂板于三抗固体选择平板，37℃过夜培养，挑取纯净白斑，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的阳性菌液质粒再次涂板于三抗固体选择平板，反复筛选，直至阳性率为100％，最终获得重组杆粒rBacmid
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M、rBacmid
‑
F、rBacmid
‑
GPI
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HA、rBacmid
‑
GPI
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VP2和rBacmid
‑
GPI
‑
Fiber
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2；步骤四、重组杆状病毒的拯救采取脂质体介导转染方式，将步骤三构建的各重组杆粒分别转染至昆虫杆状病毒表达系统中，盲传三代收获上清，利用步骤二设计的特异性引物及M13鉴定引物进行PCR鉴定，最终获得重组杆状病毒rBV
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M、rBV
‑
F、rBV
‑
GPI
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HA、rBV
‑
GPI
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VP2和rBV
‑
GPI
‑
Fiber
‑
2；步骤五、嵌合病毒样颗粒的制备及纯化将步骤四构建的重组杆状病毒rBV
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M、rBV
‑
F、rBV
‑
GPI
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HA、rBV
‑
GPI
‑
VP2和rBV
‑
GPI
‑
Fiber
‑
2按照总MOI＝5的比例接种至昆虫杆状病毒表达系统中，收集细胞上清；采用蔗糖密度梯度进行纯化，最终获得嵌合病毒样颗粒NDV
‑
AIV
‑
IBDV
‑
FAdV4 cVLPs。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，根据pFastbac
‑
1载体信息分别在HA基因、VP
‑
2基因和Fiber
‑
2基因依次引入蜂素信号肽序列、HIS标签序列、TEV切割序列和GPI信号肽序列。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述特异性引物序列如下：M
‑
Xba I
‑
F：5
’‑
TCTAGAATGGATAGCAGTCGTACGATTGGC
‑3’
，M
‑
Hind III
‑
R：5
’‑
AAGCTTTTATTTTCTGAATGGATTGTATTTCGCG
‑3’
；F
‑
Xba I
‑
F：5
’‑
TCTAGAGGATCCTTGTGGAAGGTTTTGATCCCAT
‑3’
，F
‑
Kpn I
‑
R：5
’‑
GGTACCTTAAGCACGAGTAGTTGCGCG
‑3’
；HA
‑
Xba I
‑
F：5
’‑
TCTAGAATGGAACAGGTGTCGCTC
‑3’
...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁壮，李金斗，丁佳欣，邵亚男，郭春红，冯嘉轩，辛梅，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：