一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备制造技术

本发明专利技术属于禽病预防疫苗制备技术领域，具体为一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，以小鼠白血病病毒(MLV)的Gag蛋白为基质蛋白，与采用禽流感病毒的M1蛋白所形成的颗粒相比，以Gag为基质蛋白所形成的VLPs的直径能达到150nm～200nm，其能容纳更多的外源蛋白；该方法制备的VLPs，表面同时展示了H3N2亚型禽流感病毒的HA蛋白以及H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白，因此制备的禽流感VLPs既可以预防H3N2亚型禽流感，又能够预防H9N2亚型禽流感，从而为H3N2和H9N2亚型禽流感的防控需求提供技术保障。的防控需求提供技术保障。的防控需求提供技术保障。

【技术实现步骤摘要】
一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备


[0001]本专利技术涉及禽病预防疫苗制备
，具体为一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备。

技术介绍

[0002]禽流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类急性传染病，其病原禽流感病毒的主要宿主为禽类，也可以感染哺乳动物以及人类。该病自从1878年首次在意大利暴发后，在世界各地广泛传播，给养殖业带来巨大的危害。接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效手段。目前商品化的禽流感疫苗均为灭活疫苗或病毒载体疫苗，在禽流感防控上起到了较好的作用。但是，这些疫苗依赖于鸡胚进行生产，具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产生大量的废物引起环境污染、内源病毒污染等缺点。此外，灭活疫苗只能诱导体液免疫，而不能诱导细胞免疫。因此，需要利用新的技术研发一种安全高效的禽流感疫苗，以满足现代化家禽养殖业疫病防控的需求。
[0003]病毒样颗粒(virus
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like particles，VLPs)是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力恢复的可能，安全性高，在形态上与天然病毒粒子相似，能够通过与病毒感染相同的途径，以接近真实构象的形式递呈给免疫细胞，更容易被机体免疫系统识别，从而有效诱导机体产生免疫保护反应。
[0004]VLP技术是构建新型疫苗、诊断工具和基因治疗载体的一种有前景的方法。对Zeltins(2013)公布的数据进行的分析显示，目前至少存在由35个不同家族的病毒构建而成的110个VLPs。VLP的制备可基于大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞以及昆虫杆状病毒等五种表达系统，其中昆虫杆状病毒表达系统因其表达水平高、真核处理特性和适宜大规模生产等诸多优势，而被广泛应用于多种病毒的VLP生产中，利用昆虫杆状病毒表达系统制备的VLP种类已占到了30％以上。作为一种很有前景的候选疫苗，流感VLPs已被证明既能够诱导细胞免疫和体液免疫，又可以激活先天免疫。

技术实现思路

[0005]本部分的目的在于概述本专利技术的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0006]本专利技术目的在于提供一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，利用该方法制备的VLPs表面同时展示H3N2亚型禽流感病毒的HA蛋白以及H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白，因此制备的禽流感VLPs既可以预防H3N2亚型禽流感，又能够预防H9N2亚型禽流感，从而为H3N2和H9N2亚型禽流感的防控需求提供技术保障。此外，该嵌合型禽流感VLPs可为相关新型禽流感疫苗的开发奠定良好基础。
[0007]为解决上述技术问题，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了如下技术方案：
[0008]一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，其包括如下步骤：
[0009]步骤一：由小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白、H3N2亚型禽流感病毒的HA蛋白以及H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；
[0010]步骤二：编码H3N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸；编码H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸；编码小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白和H9N2亚型禽流感病毒的NA蛋白的核苷酸；
[0011]步骤三：利用核糖体内部进入位点将小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白基因与H9N2亚型禽流感病毒的NA基因串联后进行基因合成，并将这段串联基因命名为MgagN2；
[0012]步骤四：构建表达禽流感病毒结构蛋白的重组杆状病毒，具体为：
[0013]根据H3N2亚型禽流感病毒的HA基因设计引物；以同样的方法设计H9N2亚型禽流感病毒的HA基因的引物，利用HA基因的上游和下游引物序列进行RT
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PCR扩增，将扩增后的HA基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得HA基因重组杆状病毒穿梭质粒；同样，将人工合成的MgagN2基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得MgagN2基因重组杆状病毒穿梭质粒；将穿梭质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选获得重组杆粒；利用脂质体介导转染法，将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞，获得三种重组杆状病毒，分别命名为：rBV
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H3、rBV
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H9、rBV
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MgagN2；
[0014]步骤五：禽流感VLPs的制备和纯化，具体为：
[0015]将三种重组杆状病毒rBV
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H3、rBV
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H9、rBV
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MgagN2共接种感染Sf9昆虫细胞，四种结构蛋白在表达并自行组装后，所形成的VLPs会分泌到细胞培养上清中，经低速离心去除细胞碎片后，采用不连续的40％
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60％蔗糖密度梯度离心方法得到纯化的VLPs。
[0016]作为本专利技术所述的一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备的一种优选方案，其中：步骤五中，三种重组杆状病毒共接种感染Sf9昆虫细胞时，含有重组杆病毒的溶液体积比为：rBV
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H3:rBV
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H9:rBV
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MgagN2＝1:1:3。
[0017]作为本专利技术所述的一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备的一种优选方案，其中：HA蛋白分别来自H3N2和H9N2亚型禽流感病毒；基质蛋白为小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白。
[0018]作为本专利技术所述的一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备的一种优选方案，其中：H3N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.1：
[0019]>SEQIDNO.1
[0020]atgaggaccgttattgcattgagctacattctctgcttggcttttggacagaaccttccagggaatgacaacagtacagcaacactatgcctgggacatcatgcagtgccgaatggaacaatagtgaaaacaatcaccgacgatcagattgaggtgaccaatgctactgagctggtccaaagttcctcaacagggaaaatatgcaacaatccccacaagatccttgatggaagagattgcacattaatagatgccatgcttggagatcctcattgtgatgtttttcaagatgagacatgggatctcttcgttgagcgaagcaatgctttcagcaattgttatccttatgatgtaccggattatgcctcccttcgatccttagttgcttcatcaggc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：由小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白、H3N2亚型禽流感病毒的HA蛋白以及H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；步骤二：编码H3N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸；编码H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸；编码小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白和H9N2亚型禽流感病毒的NA蛋白的核苷酸；步骤三：利用核糖体内部进入位点将小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白基因与H9N2亚型禽流感病毒的NA基因串联后进行基因合成，并将这段串联基因命名为MgagN2；步骤四：构建表达禽流感病毒结构蛋白的重组杆状病毒，具体为：根据H3N2亚型禽流感病毒的HA基因设计引物；以同样的方法设计H9N2亚型禽流感病毒的HA基因的引物，利用HA基因的上游和下游引物序列进行RT
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PCR扩增，将扩增后的HA基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得HA基因重组杆状病毒穿梭质粒；同样，将人工合成的MgagN2基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得MgagN2基因重组杆状病毒穿梭质粒；将穿梭质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选获得重组杆粒；利用脂质体介导转染法，将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞，获得三种重组杆状病毒，分别命名为：rBV
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H3、rBV
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H9、rBV
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MgagN2；步骤五：禽流感VLPs的制备和纯化，具体为：将三种重组杆状病毒rBV
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H3、rBV
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H9、rBV
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MgagN2共接种感染Sf9昆虫细胞，四种结构蛋白在表达并自行组装后，所形成的VLPs会分泌到细胞培养上清中，经低速离心去除细胞碎片后，采用不连续的40％
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60％蔗糖密度梯度离心方法得到纯化的VLPs。2.根据权利要求1所述的一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，其特征在于：步骤五中，三种重组杆状病毒共接种感染Sf9昆虫细胞时，含有重组杆病毒的溶液体积比为：rBV
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H3:rBV
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H9:rBV
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MgagN2＝1:1:3。3.根据权利要求1所述的一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，其特征在于：HA蛋白分别来自H3N2和H9N2亚型禽流感病毒；基质蛋白为小鼠白血病病毒(MLV)Gag蛋白。4.根据权利要求1所述的一种H3N2与H9N2亚型禽流感二价嵌合型病毒样颗粒的制备，其特征在于：H3N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.1：>SEQIDNO.1atgaggaccgttattgcattgagctacattctctgcttggcttttggacagaaccttccagggaatgacaacagtacagcaacactatgcctgggacatcatgcagtgccgaatggaacaatagtgaaaacaatcaccgacgatcagattgaggtgaccaatgctactgagctggtccaaagttcctcaacagggaaaatatgcaacaatccccacaagatccttgatggaagagattgcacattaatagatgccatgcttggagatcctcattgtgatgtttttcaagatgagacatgggatctcttcgttgagcgaagcaatgctttcagcaattgttatccttatgatgtaccggattatgcctcccttcgatccttagttgcttcatcaggcacactagaattcattactgaaggtttcacctggacaggagtgagccagaatggaggaagcggtgcctgcaaaaggggacctgccaacggtttcttcggtagattgaactggttgactaagtcagggaactcatacccactgttaaacgtgactatgccaaacaatgataattttgacaagctatacatctggggtgttcaccacccgagtacaaaccaagaacagactaacctgtatgttcaggcctcaggaagagtcacagtctctaccaggagaagtcaacagaccatagtcccgaacattggatctagaccttgggtaaggggtcaatctggaagaataagcatctactggacaata
gtcaaacctggagatgtaccggtaatcaatagtaacggaaacctgattgcgcctcggggatacttcaagatccgaactgggaaaagctcaataatgagatcagatgcacctatagagacttgcatctcagaatgcatcactccaaatggaagcatccctaatgacaagccttttcaaaatgtaaacaaaatcacatacggggcatgtcccaaatatgtaaagcaaaataccctaaaattggctacaggaatgaggaatgtgcctgagaagcaaaccagaggtctattcggtgcaatagcagggttcatagagaatggatgggaaggaatgatagatggctggtatggcttcagacaccaaaattctgaaggcacaggacaagcagcagatcttaaaagcacccaagcggccattgaccaaatcaatgggaaattgaacagagtgattgaaaagacgaatgaaaaattccatcagatcgaaaaagaattctccgaggttgaaggaaggattcaagatcttgagaaatatgtcgaagacacaaaggtggacctctggtcttataatgcagagcttcttgttgctctagagaatcagcatacaattgatttgaccgattctgagatgaacaagttatttgaaaaaaccagaaggcaactgagagagaatgctgaagacatgggcaatggttgcttcaaaatatatcacaaatgtgacaatgcctgcatagaatcaattaggaatggaacttatgaccatgacatatatcgagatgaggcactgaacaatcggttccagatcagaggtgtagaactaaaatctggatacaaagactggatcctgtggatttcctttgccatatcatgctttttgctttgtgttgtgttgttggggttcattatgtgggcttgccagcgaggcaacattaggtgcaacatttgcatttga；H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.2：>SEQIDNO.2atgggagccgtatcattgataactatgctactagtagcaacagtaagcaatgcagacaaaatctgcatcggataccaatcaacaaactccacagaaactgtagacacactaacagaaaacaatgtccctgtgacacatgccaaagaattgctccacacagagcacaatgggatgctatgtgcaacaaacttgggacatcctcttattctagacacctgtaccattgcaggactaatctatggcaatccttcttgtgatctattgctgggaggaagagaatggtcttacatcgtcgagagaccatcggctgtcaatggattgtgctaccccggga...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛彦龙，孙艺学，宿甲子，邓效禹，凌蒙蒙，李佳新，秦佳仪，王玮，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：