一种表达非洲猪瘟O61R蛋白的重组杆状病毒及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种表达非洲猪瘟O61R蛋白的重组杆状病毒，采用该重组杆状病毒在昆虫细胞中表达非洲猪瘟O61R蛋白，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种表达非洲猪瘟O61R蛋白的重组杆状病毒及其用途


[0001]本专利技术涉及一种表达非洲猪瘟O61R蛋白的重组杆状病毒及其用途。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪急性、高度接触性和高度致死性地传染性疾病，主要感染家猪和野猪，可引起猪只发热，食欲减退，呼吸困难，内脏器官广泛性出血，神经系统紊乱等临床症状，一旦感染，致死率高达100％。2018年在我国暴发以来，对我国养猪业的发展造成了严重的影响。目前，仍未有商品化的疫苗问世，由于ASFV可以编码蛋白约200种，且大多数功能未知，如何选择有效的抗原组合是非洲猪瘟亚单位疫苗开发的关键。
[0003]亚单位疫苗通过表达病毒粒子上的免疫原性基因作为抗原来引发保护性免疫应答，无病原基因组，具有副作用少、安全性高、可以快速批量生产，被认为是未来开发ASF疫苗的理想选择。O61R编码p12蛋白，由61个氨基酸编码的膜蛋白，位于病毒的外膜及内膜，C末端部分存在一个富含半胱氨酸的区域，该区域可能负责蛋白质形成二聚体，仅在感染后晚期转录，对来自11种不同病毒株的蛋白p12的氨基酸序列的比较揭示了该多肽的高度保守性。研究发现p12可能与病毒的吸附和入侵有关。将O61R克隆到改良牛痘病毒安卡拉(MVA)病毒载体中进行免疫，产生了针对p12的特异性抗体，说明该基因具有较好的免疫原性，并且序列高度保守，是未来亚单位疫苗开发的候选基因。
[0004]昆虫细胞杆状病毒表达载体系统不仅能够大量表达外源蛋白还能对其进行较为完善的翻译后加工修饰。昆虫细胞易于大规模培养，可有效降低生产成本。同时昆虫细胞不能被人类病原体所感染，生物安全性好。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足而提供一种非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒、一种非洲猪瘟O61R蛋白重组穿梭质粒、一种表达非洲猪瘟O61R蛋白的重组杆状病毒及其用途。
[0006]为实现上述目的，所采取的技术方案：一种非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒，所述非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒是将非洲猪瘟O61R基因连接至病毒载体上得到的。
[0007]优选地，所述非洲猪瘟O61R基因的扩增引物包括如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物。
[0008]优选地，所述病毒载体为pACEBac1或pFastBac1。
[0009]优选地，所述非洲猪瘟O61R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。优选地，所述O61R基因为基因II型的非洲猪瘟病毒毒株中的基因。优选地，所述非洲猪瘟O61R蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0010]本专利技术提供了一种非洲猪瘟O61R蛋白重组穿梭质粒，所述非洲猪瘟O61R蛋白重组穿梭质粒是将如上述所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒转化至DH10Bac感受态细胞中
得到的。
[0011]本专利技术提供了一种表达非洲猪瘟O61R蛋白的重组杆状病毒，所述重组杆状病毒是将上述所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组穿梭质粒转染至昆虫细胞，培养至昆虫细胞出现病变，收集上清液得到的。
[0012]优选地，所述昆虫细胞为Sf9细胞或者High 5细胞。
[0013]本专利技术提供了一种制备非洲猪瘟O61R蛋白的方法，所述方法是将上述所述的重组杆状病毒接种至含有昆虫细胞的溶液或者活体昆虫中进行表达，得到非洲猪瘟O61R蛋白。优选地，所述昆虫细胞为Sf9细胞。优选地，所述重组杆状病毒以MOI＝0.5接种至含有昆虫细胞的溶液或者活体昆虫中。
[0014]本专利技术提供了所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒、上述所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组穿梭质粒、上述所述的重组杆状病毒在制备非洲猪瘟O61R蛋白中的用途。
[0015]本专利技术提供了上述所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒、上述所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组穿梭质粒、上述所述的重组杆状病毒在制备诊断非洲猪瘟的制品或制备非洲猪瘟亚单位疫苗中的用途。
[0016]有益效果：
[0017]本专利技术构建了含ASFV O61R的重组杆状病毒载体，采用该重组杆状病毒载体，利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了非洲猪瘟O61R蛋白，为建立安全、可靠的非洲猪瘟亚单位疫苗奠定了基础。
[0018]本专利技术使用昆虫细胞Sf9重组表达非洲猪瘟O61R蛋白，蛋白表达量高，可用于制备鉴别诊断制品，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。
[0019]杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，该真核表达系统既可以在昆虫细胞中表达也可以在活体昆虫中表达；
[0020]杆状病毒表达系统具有的相对于其他表达系统更为特殊的优势是作为表达载体的杆状病毒基因组可以容纳更多的外源基因；
[0021]在昆虫细胞中进行蛋白的表达，可以大规模悬浮培养，能够对外源蛋白进行一定的加工修饰，接近于蛋白的天然结构；
[0022]杆状病毒一般仅仅感染节肢动物，对人和动物没有危害，安全可靠。
[0023]O61R基因编码p12蛋白，由61个氨基酸编码的膜蛋白，位于病毒的外层，是ASFV的结构蛋白，免疫原性良好，是重要的ASFV亚单位疫苗备选基因之一。
附图说明
[0024]图1为本专利技术重组转移质粒pACEBac1
‑
O61R的酶切验证结果，M1为DL2000DNA Marker，泳道1为双酶切结果，目的产物长度分别约为5000bp和200bp，M2为DL 5000DNA Marker。
[0025]图2为重组穿梭质粒菌液PCR鉴定结果，M1为DL 2000DNA Marker，泳道1为O61R特异性引物PCR鉴定结果，泳道2为M13通用引物PCR鉴定结果，泳道3和4为阴性对照，M2为DL 5000DNA Marker。
[0026]图3为间接免疫荧光试验验证结果。其中A为转染了重组杆状病毒的Sf9细胞，B为正常的Sf9昆虫细胞。
[0027]图4为Western
‑
Blot鉴定O61R基因表达结果，M：180kDa蛋白Marker；1：转染重组杆状病毒的Sf9细胞破碎后上清；2：正常Sf9细胞破碎后上清。
具体实施方式
[0028]为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。
[0029]实施例1
[0030]1、重组转移质粒pACEBac1
‑
O61R的构建，具体包括以下步骤：
[0031]扩增O61R基因引物的设计：设计扩增O61R基因全长的引物，在引物3
’
端引入His标签便于后期表达鉴定，在引物5
’
端添加BamH I，在3
’
端添加Hind III限制性酶切位点序列，用于后期克隆。设计引物如下，Bac
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒，其特征在于，所述非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒是将非洲猪瘟O61R基因连接至病毒载体上得到的。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒，其特征在于，所述非洲猪瘟O61R基因的扩增引物包括如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物。3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒，其特征在于，所述病毒载体为pACEBac1或pFastBac1。4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒，其特征在于，所述非洲猪瘟O61R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。5.一种非洲猪瘟O61R蛋白重组穿梭质粒，其特征在于，所述非洲猪瘟O61R蛋白重组穿梭质粒是将如权利要求1
‑
4任一所述的非洲猪瘟O61R蛋白重组转移质粒转化至DH10Bac感受态细胞中得到的。6.一种表达非洲猪瘟O61R蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊惠英，王召阳，何恒昌，林熙炜，艾强云，谢翰高，欧雅婷，黄圣林，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：