一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用技术方案

本发明专利技术涉及一种高效丝素重链分泌型重组表达系统的建立与应用，利用一类增强子hr3、非翻译区序列3

【技术实现步骤摘要】
al.2006)、部分胶原蛋白肽段(Yanagisawa et al.2007)，以及P25融合的红色荧光蛋白(Royer et al.2005)等；在中部丝腺表达了人血清白蛋白(Ogawa et al.2007)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita et al.(2007)、鼠单克隆抗体(Iizuka et al.2009)、人胶原蛋白α链基因(Adachi et al.2010)以及可溶性GM
‑
Csf受体α(Urano et al.2010)等。但总体上，上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：这类丝素重链表达系统由于调控元件较为单一，并且外源蛋白需要与内源丝蛋白进行融合才能实现分泌表达，对外源蛋白的表达量和生物活性产生不利影响，研究人员尝试过蛋白复性策略，但是流程繁琐且收效甚微，因而极大的限制的丝素重链表达系统的应用。所以，有必要对现有的丝素重链表达系统进行改造，以提高外源蛋白的表达效率与生物活性，推动家蚕丝腺生物反应器技术体系在生物制药和功能性蚕丝遗传改良领域中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术中存在的上述问题，提供一种高效丝素重链启动子分泌表达系统，解决了现有丝素重链表达系统由于调控元件较为单一，并且外源蛋白需要与内源丝蛋白进行融合才能实现分泌表达，对外源蛋白的表达量和生物活性产生不利影响的问题。
[0006]本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
[0007]一种高效丝素重链pBac载体的构建方法，其特征在于，所述pBac载体包括pBac
‑r/>FRF 载体、pBac
‑
HFRF载体、pBac
‑
HFRS载体、pBac
‑
HFlRS载体；所述pBac
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HFRF载体、pBac
‑
HFRS 载体、pBac
‑
HFlRS载体是由所述pBac
‑
FRF载体形成的插入型载体；所述pBac载体的构建包括以下步骤：
[0008]1)采用特异性引物以phSRSV载体为模板进行PCR扩增，得到红色荧光蛋白DsRed1、 hr3 CQ增强子和Ser1pA终止子，将得到的片段分别克隆到pMD 19T simple载体中，分别得到pDsRed1载体、phr3载体和pSer1pA载体；
[0009]2)采用特异性引物以家蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到F(1967)，将得到的 F(1967)片段克隆到pMD19T simple载体中，得到pF1967载体，F(1967)的序列如SEQ ID No.1 所示；
[0010]采用特异性引物以FibHpolyA(FibHpA)终止子为模板进行PCR扩增，将得到的DNA 片段克隆到pMD19T simple载体中，得到pFibHpA载体；
[0011]3)将pDsRed1载体上用BamH I和Not I酶切得到的DsRed1片段连接到用BamH I和 Not I酶切后的pF1967载体上，得到pFR载体；
[0012]将p
‑
FibHpA载体上用Not I和Kpn I酶切得到的FibHpA片段连接到用Not I和Kpn I酶切后pFR载体上，得到pFRF载体，pFRF的序列如SEQ ID No.2所示；
[0013]4)将pFRF载体用AscⅠ酶切得到FRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中，得到pBac
‑
FRF载体。
[0014]进一步的，一种高效丝素重链pBac
‑
HFRF载体的构建方法，包括以下步骤：将hr3插入 pFRF载体得到pHFRF载体，pHFRF的序列如SEQ ID No.2所示，将pHFRF载体用AscI酶切得到HFRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成pBac
‑
HFRF。
[0015]进一步的，一种高效丝素重链pBac
‑
HFRS载体的构建方法，包括以下步骤：将pHFRF 载体中的FibHpA用Ser1pA替换生成pHFRS；pHFRS的序列如SEQ ID No.2所示，将pHFRS 载体
用AscI酶切得到HFRS片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成 pBac
‑
HFRS。
[0016]进一步的，一种高效丝素重链pBac
‑
HFIRS载体的构建方法，包括以下步骤：在pHFRS 中，用Exon2(GenBank登录号AF226688，nt.63451
‑
63846)替换Exon2 NTD 2AA以生成载体pHFlRS；将pHFIRS载体用AscI酶切得到HFIRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成pBac
‑
HFIRS。
[0017]一种上述高效丝素重链pBac载体在制备高效丝素重链启动子分泌表达系统中的应用。
[0018]一种高效丝素重链启动子分泌表达系统，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
[0019]1)将pBac载体与辅助质粒pHA3PIG以质量比为1:1的比例一起注入G0代卵中，饲养后得到G0蛾子，然后进行交配制种得到G1代；
[0020]2)用荧光显微镜对G1代卵的眼睛或神经是否有荧光进行阳性个体筛选获得转基因家蚕，获得的转基因家蚕饲养、传代，保留pBac
‑
FRF载体、pBac
‑
HFRF载体、pBac
‑
HFRS载体单拷贝的阳性转基因个体分别为FRF品系、HFRF品系和HFRS品系。
[0021]进一步的，所述pBac载体中pBac
‑
FRF载体、pBac
‑
HFRF载体、pBac
‑
HFRS载体在染色体上的插入位点分别为1号染色体、25号染色体和20号染色体。
[0022]一种上述高效丝素重链启动子分泌表达系统在家蚕生物反应器中合成和分泌成熟的重组蛋白中的应用。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0024]1)建立了一种高效的丝素重链分泌表达系统，实现了外源蛋白在蚕丝中以其天然大小的分子量大量分泌且具备活性，与之前的丝素表达系统相比在应用上更有前景。
[0025]2)高效的丝素重链分泌表达系统可用于生物反应器中表达和分泌成熟的重组蛋白，而且在N
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末端没有任何额外的丝素重链氨基酸残基不会影响蛋白的大小。
附图说明
[0026]图1为本专利技术一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中丝素重链启动子 pBac表达载体构建示意图。
[0027]图2为本专利技术一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中转基因家蚕阳性个体的筛选示意图。
[0028]附图2中a、b、g和h为FRF品系,c、d、i和j本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效丝素重链pBac载体的构建方法，其特征在于，所述pBac载体包括pBac
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FRF载体、pBac
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HFRF载体、pBac
‑
HFRS载体、pBac
‑
HFlRS载体；所述pBac
‑
HFRF载体、pBac
‑
HFRS载体、pBac
‑
HFlRS载体是由所述pBac
‑
FRF载体形成的插入型载体；所述pBac载体的构建包括以下步骤：1)采用特异性引物以phSRSV载体为模板进行PCR扩增，得到红色荧光蛋白DsRed1、hr3 CQ增强子和Ser1pA终止子，将得到的片段分别克隆到pMD 19T simple载体中，分别得到pDsRed1载体、phr3载体和pSer1pA载体；2)采用特异性引物以家蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到F(1967)，将得到的F(1967)片段克隆到pMD19T simple载体中，得到pF1967载体；采用特异性引物以FibHpA终止子为模板进行PCR扩增，将得到的DNA片段克隆到pMD19T simple载体中，得到pFibHpA载体；3)将pDsRed1载体上用BamH I和Not I酶切得到的DsRed1片段连接到用BamH I和Not I酶切后的pF1967载体上，得到pFR载体；将p
‑
FibHpA载体上用Not I和Kpn I酶切得到的FibHpA片段连接到用Not I和Kpn I酶切后pFR载体上，得到pFRF载体；4)将pFRF载体用AscⅠ酶切得到FRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中，得到pBac
‑
FRF载体。2.如权利要求1所述一种高效丝素重链pBac载体的构建方法，其特征在于，所述pBac
‑
HFRF载体的构建方法包括以下步骤：将hr3插入pFRF载体得到pHFRF载体，将pHFRF载体用AscI酶切得到HFRF片段，将其插入pBac[3xP3DsRedaf]转基因载体中生成pBac
‑
HFRF。3.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，夏庆友，许胜，赵萍，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：