一种表达PCV2dcap蛋白的载体及方法技术

本发明专利技术公开了一种表达PCV2d cap蛋白的载体及方法，使用Bac

【技术实现步骤摘要】
一种表达PCV2d cap蛋白的载体及方法


[0001]本专利技术属于杆状病毒表达载体系统
，具体涉及一种表达PCV2d cap蛋白的载体及方法。

技术介绍

[0002]1993年出现了Bacmid技术，Bacmid是组装有杆状病毒DNA的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosomes,BACs)，因此Bacmid可以维持于大肠杆菌细胞内并在大肠杆菌中增殖，Bac
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to Bac具有“Bacteria”到“Baculovirus”之意。杆状病毒表达载体系统包含3个部分:转移质粒、杆状病毒表达载体和昆虫细胞。转移质粒由Ph或P10启动子、启动子下游的多克隆位点、polyA序列、需要可在外源基因N端加入GP64、蜂毒素或几丁质酶等信号肽促使蛋白分泌表达，在开放阅读框N端或C端加入6x组氨酸标签利于蛋白纯化，TEV酶切位点可用于后期组氨酸标签的移除。感受态大肠杆菌DH10Bac中包含两个质粒:穿梭质粒和辅助质粒。穿梭质粒(Bacmid)具有在细菌中低拷贝mini
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F复制子、mini
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attTn7转座位点、卡纳霉素抗性基因的杆状病毒基因组，不含有杆状病毒多角体蛋白；辅助质粒编码转座酶，可维持在大肠杆菌中，使转移质粒上的表达盒通过转座作用定向转移到杆状病毒表达载体上，含有四环素抗性基因。
[0003]转移质粒转化到感受态细胞中后，在转座酶催化作用下，将Tn7转座子左右臂定向转移到Bacmid的Tn7位点，形成具有外源基因的Bacmid。转移载体中携带有LacZ基因，其产生的a
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肽与宿主菌的a
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肽互补可编码β半乳糖苷酶，经过IPTG诱导分解底物X
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gal形成蓝色噬菌斑。当外源基因插入到转移载体中LacZ的多克隆位点，导致LacZ失活，破坏了a.
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肽的互补形成，在含有X
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gaL和IPTG的平板中生长白色噬菌斑。因此重组质粒可在相应抗性、IPTG和X
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gal(或Bluo
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gal)底物的琼脂糖平板上通过蓝白斑筛选获得，然后经过碱裂解方法获得病毒DNA，纯化的杆粒DNA用于转染昆虫细胞，生产具有感染性的BV。
[0004]第二代商品化BEVS为Invitrogen公司生产的Bac
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to
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BacTM该表达系统，杆状病毒表达载体优势:(i)昆虫细胞是真核细胞，具有完备的翻译后加工修饰功能，重组蛋白与天然蛋白具有相似的生物活性；(ii)外源基因容量大，杆状病毒表达载体大小约为134kbp,适合较大的基因克隆和同时多个基因的克隆；(iii)生物安全性好，杆状病毒不感染包括人在内的哺乳动物；(iv)在强启动子Ph或P10的调控下，重组蛋白具有很高的表达水平。该系统生产的杆状病毒不需要蚀斑纯化过程，然而，需要通过抗性基因从亲代病毒DNA中筛选重组病毒DNA，含有重组病毒DNA的细菌增殖过程以及重组病毒DNA的抽提纯化过程，均可能会影响杆状病毒粒子的稳定性，甚至导致重组病毒表达丢失。
[0005]autographa California multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)是研究最广泛且应用较多的一种杆状病毒，以AcMNPV为基础的杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system,BEVS)发展迅速，已成为应用最普遍的表达系统之一。第一代商品化BEVS是Clontech生产的BacPAK6TM，该表达系统对AcMNPV基因组进行以下修饰，即经过Bsu361酶切，病毒DNA线性化，除去了lacZ基因和
orf1629的部分基因，导致病毒在昆虫细胞中无法复制的病毒DNA与转移载体混合后转染到昆虫细胞进行同源重组，表达盒插入到病毒DNA,修复了orf1629基因，病毒DNA恢复环形，同时恢复了感染性。但由于Bsu361酶切效率并不是100％，转染出的病毒是亲代病毒和重组病毒的混合物，需要进一步的蚀斑纯化实验，将重组病毒从亲代病毒中筛选出来。
[0006]FlashBAC
TM BEVS对AcMNPV基因组进行了改造，AcMNPV病毒DNA缺失orf1629基因部分序列和BAC取代多角体蛋白基因。缺失了orf1629部分基因序列的病毒DNA不能在昆虫细胞内复制，BAC取代多角体蛋白基因后，病毒DNA能在细菌细胞内维持并进行低拷贝复制。改造后病毒DNA在细菌中增殖后,经碱裂解和氯化铯梯度纯化，获得用于共转染的flashBACM
TM
病毒DNA，与带有外源基因的转移质粒共转染于昆虫细胞，通过细胞内同源重组，重组病毒的orf1629基因完整，病毒恢复复制功能，外源基因同时插入到病毒DNA中，重组杆状病毒获得拯救。该系统中，去除了蓝白斑筛选过程，亲代病毒不可能在昆虫细胞中复制。
[0007]FlashBAC
TM
GOLD BEVS是在flashBAC
TM
基础上缺失了几丁质酶基因(chiA)和组织蛋白酶基因(v
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cath)。ChiA是一个辅助基因，编码的酶能够促进细胞内切酶和外切酶的活性。对于感染的昆虫细胞，chiA表达于感染的晚期，与组织蛋白酶一起促进宿主表皮分解和组织溶解，从而释放病毒，感染更多的宿主细胞。已有文献报道，缺失病毒基因组中chiA和(或)v
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cath基因，可提高昆虫细胞和昆虫幼虫蛋白稳定性。Possee等将chiA基因从杆状病毒基因组缺失后，分泌性重组蛋白表达水平提高；Lee等在B.mori幼虫中表达纤维素酶，表达量提高了17％；Suzuki等用缺失v
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cath的杆状病毒表达萤火虫荧光素酶和人生长因子,发现蛋白稳定性大大增加；Park等使用缺失chiA/v
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cath的病毒在B.mori中表达GFP融合蛋白，血淋巴中几丁质酶和组织蛋白酶的活性分别降低了95％和50％，与未修饰的病毒相比，表达的GFP(uv)
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beta、3
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N
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葡萄糖胺乙酰转移酶降解量减少，活性增加了2.8倍。FlashBAC
TM
GOLD杆状病毒表达载体不仅增加了分泌蛋白的表达量，同时提高了重组蛋白的稳定性。
[0008]FlashBAC
TM
ULTRABEVS是在flash
TM
BACGOLD基础上,缺失了p10、p26和p74基因。
[0009]Silvia等将BEVS的双表达盒载体进行了改造，polh启动子后克隆杆状病毒源激活因子ie0、iel；p6.9p10双启动子代替原来的p10启动子，与杆状病毒源的增强子hrl顺式连接，启动外源蛋白的表达，polhAc
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ie
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01/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达PCV2d cap蛋白的载体，由骨架载体和插入其启动子P10下游的多克隆位点的一个或多个PCV2d cap蛋白编码基因构成，所述骨架载体的启动子P10和其下游的多克隆位点之间插入了如SEQ ID.No.6所示的转录后调控序列WPRE，所述骨架载体的启动子Ph被替换为如SEQ ID.No.4所示的启动子SV40，或启动子Ph和启动子P10之间插入了如SEQ ID.No.5所示的增强子hr1。2.根据权利要求1所述的表达PCV2d cap蛋白的载体，其特征在于，所述PCV2d cap蛋白编码基因的核苷酸序列根据杆状病毒密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求2所述的表达PCV2d cap蛋白的载体，其特征在于，所述的骨架载体为pFast Bac Dual。4.一种表达PCV2d cap蛋白的方法，其特征在于，将权利要求1～3任一项所述PCV2d cap蛋白的编码基因，与骨架载体连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤细彪，黄超，黄英，杨柳，宋文博，龙云志，刘锦锦，李倩倩，梁巩，余道兵，周明光，徐高原，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：