一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其应用，该表达盒包含从5

【技术实现步骤摘要】
一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，更具体地，涉及一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其应用。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(adeno
‑
associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。重组腺相关病毒(rAAV)由于具有宿主范围广、免疫原性低、安全性高、可介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是目前基因治疗领域最具应用前景的载体之一。随着第一种重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因治疗药物的批准，对大规模AAV载体制造技术的需求不断增加(Yla
‑
Herttuala S.,2012,Mol Ther,20:1831
‑
1832)。
[0003]目前，生产rAAV的体系主要有两大类：一种是利用哺乳动物细胞(如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞等)的常规生产体系；另一种是利用昆虫细胞的生产体系。在哺乳动物细胞生产体系中，单个细胞的rAAV颗粒产量低，并且培养中极可能存在污染的风险，这限制了rAAV在哺乳动物细胞中的大规模生产及应用。重组腺相关病毒基因组中cap基因编码病毒VP衣壳蛋白，包括三种结构蛋白，分别为VP1、VP2和VP3，来自野生型病毒的AAV中VP1、VP2和VP3的化学计量比约为1:1:10，这样的化学计量比对于重组AAV的获得是很重要的。在哺乳动物细胞培养系统中，取得了三种AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的约为1:1:10的化学计量比，这依赖于哺乳动物细胞内含子两个剪接受体序列的交替使用以及对于VP2次优起始密码子ACG的使用。然而，由于哺乳动物细胞和昆虫细胞中内含子剪接机制的差异，在哺乳动物细胞中出现的表达策略不会在昆虫细胞中复制，从而导致野生型AAV在昆虫细胞中无法包装成合适的衣壳。
[0004]为了克服上述问题，Urabe等人开发出了昆虫细胞生产体系，将VP1的起始密码子AUG替换为次优起始密码子ACG，构建一个单一的多顺反子mRNA，该多顺反子mRNA不需要剪接即可表达所有三种AAV2的VP蛋白(Urabe等,2002,Hum Gene Ther,13:1935
‑
1943)。然而AAV的血清型众多且与日俱增，Urabe等人的改造方法并不适用于所有血清型，例如Urabe等人使用ACG作为VP1衣壳蛋白起始密码子的杆状病毒系统中产生的AAV5颗粒具有不佳的感染性。在中国专利CN106544325A提供的方法中使用不同的次优起始密码子CTG加强VP1的表达，尽管这种设计提高了AAV5颗粒的感染性，但这种方法在调节VP1/VP2/VP3相对含量方面缺乏灵活性；同时，该方法似乎也缺乏血清型特异性序列调整所必须的灵活性。在中国专利CN101522903A提供的方法中通过将包含有polh启动子序列的人工内含子插入到VP1的开放阅读框中，利用两个启动子分别表达VP1和VP2/VP3，该设计虽然也能实现VP1/VP2/VP3在同一阅读框中表达，但该方法同样不能有效调节VP1/VP2/VP3相对量，且在不同血清型中VP1/VP2/VP3的相对表达量差异较大，导致生产效率较低。
[0005]在AAV昆虫细胞生产体系中，Urabe等人构建了Rep78和Rep52两个独立的表达盒，
并插入在同一个杆状病毒载体中。由于Rep78的低表达有利于AAV的包装，Rep52使用了Polh启动子，Rep78则使用了相对Polh启动子启动活性较弱的
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IE1启动子(Urabe等,2002,Hum Gene Ther,13:1935
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1943)。然而，有研究发现，Urabe等人开发的AAV Rep蛋白表达方法存在杆状病毒载体传代不稳定的问题，为了解决这一问题，中国专利CN 103849629 A公开了一种昆虫细胞中产生AAV的方法，将AAV Rep78蛋白的翻译起始密码子替换成ACG，该方法虽然能实现在同一阅读框的Rep78和Rep52蛋白的表达，但缺乏对Rep78和Rep52蛋白相对表达的调控作用。
[0006]因此，开发能够在昆虫细胞中稳定和大规模地生产重组腺相关病毒的手段和方法是非常必要的。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其应用。本专利技术利用内含子选择性剪接调控作用，在转录后加工过程中对VP1蛋白编码序列的翻译起始密码子AUG选择性的保留、缺失或形成，在昆虫细胞中实现cap基因重叠开放阅读框中VP蛋白(VP1/VP2/VP3)按照正确的化学计量表达；同样地，利用内含子选择性剪接调控作用，在转录后加工过程中对Rep78蛋白编码序列的翻译起始密码子AUG选择性的保留、缺失或形成，在昆虫细胞中实现rep基因重叠开放阅读框中Rep蛋白(Rep78/Rep52)以合适的比例表达；旨在解决昆虫细胞中稳定和大规模生产具有较高包装率和感染活性的各种血清型的重组腺相关病毒的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒，其包含从5
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至3
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的、可操作连接的：
[0009]能够在昆虫细胞中驱动转录的启动子；
[0010]人工构建序列；
[0011]仅缺少第一个翻译起始密码子的重叠开放阅读框；
[0012]其中，所述人工构建序列包含在昆虫细胞中有剪接活性的天然的或经过人工改造的内含子，所述内含子中包含翻译起始密码子ATG，或者所述内含子位于ATG中的任意相邻两个核苷酸之间；
[0013]在转录后加工过程中，通过内含子的选择性剪接作用，使得所述人工构建序列中的翻译起始密码子AUG保留或缺失，或者在所述人工构建序列中形成翻译起始密码子AUG，从而实现调控所述重叠开放阅读框中不同蛋白编码基因的翻译表达。
[0014]优选地，所述人工构建序列包含从5
’
至3
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的、可操作连接的：
[0015]所述内含子的5
’
部分；
[0016]翻译起始密码子ATG；
[0017]所述内含子的3
’
部分；
[0018]编码2A自剪切多肽的核苷酸序列。
[0019]优选地，所述2A自剪切多肽为T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。
[0020]优选地，所述人工构建序列包含从5
’
至3
’
的、可操作连接的：
[0021]第一内含子的5
’
部分；
[0022]翻译起始密码子ATG；
[0023]第二内含子的5
’
部分；
[0024]所述内含子的3<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒，其特征在于，包含从5
’
至3
’
的、可操作连接的：能够在昆虫细胞中驱动转录的启动子；人工构建序列；仅缺少第一个翻译起始密码子的重叠开放阅读框；其中，所述人工构建序列包含在昆虫细胞中有剪接活性的天然的或经过人工改造的内含子，所述内含子中包含翻译起始密码子ATG，或者所述内含子位于ATG中的任意相邻两个核苷酸之间；在转录后加工过程中，通过内含子的选择性剪接作用，使得所述人工构建序列中的翻译起始密码子AUG保留或缺失，或者在所述人工构建序列中形成翻译起始密码子AUG，从而实现调控所述重叠开放阅读框中不同蛋白编码基因的翻译表达。2.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于：所述人工构建序列包含从5
’
至3
’
的、可操作连接的：所述内含子的5
’
部分；翻译起始密码子ATG；所述内含子的3
’
部分；编码2A自剪切多肽的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述2A自剪切多肽为T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。4.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于：所述人工构建序列包含从5
’
至3
’
的、可操作连接的：第一内含子的5
’
部分；翻译起始密码子ATG；第二内含子的5
’
部分；所述内含子的3
’
部分；其中，所述第二内含子的5
’
部分内部有终止密码子，所述终止密码子与所述翻译起始密码子ATG之间的核苷酸数为3的倍数。5.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于：所述内含子的5
’
端核苷酸为GTNN，所述内含子的3
’
端核苷酸为NNAG，其中N为A、T、C、G四种核苷酸中的任意一种。6.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于：所述包含重叠开放阅读框的基因为AAV的cap基因或AAV的rep基因。7.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于：所述启动子为polh启动子或p10启动子。8.根据权利要求7所述的表达盒，其特征在于：所述包含重叠开放阅读框的基因为AAV的cap基因，所述启动子为p10启动子。9.根据权利要求7所述的表达盒，其特征在于：所述包含重叠开放阅读框的基因为AAV的rep基因，所述启动子为polh启动子。10...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：武汉枢密脑科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：