用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用。本发明专利技术公开的一组调控基因在肝脏系统高表达的重组核酸序列。所述重组调控序列片段与目前所报道的相近尺寸大小的其他序列相比，驱动报告基因和人凝血因子FVIII在肝脏系统中表达能力明显增强，持续高水平表达能力增强，适用于重组腺病毒伴随病毒(rAAV)介导的基因治疗。

【技术实现步骤摘要】
用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用
本专利技术属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用。
技术介绍
基因治疗(genetherapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，最终实现治疗目的。20世纪90年代以来，基因治疗技术已从实验室研究走向临床实际应用。从单纯的遗传病基因治疗，迅速扩展到肿瘤治疗领域，近年又研究作为抗病毒治疗正在深入研究中。肝脏的基因治疗是将治疗基因导入肝脏，以肝细胞作为生物反应细胞，进行治疗基因表达，产生治疗性蛋白质类进入血循环，达到治疗目的；同时又可以肝脏作为靶器官，治疗肝脏疾病。1992年Wilson等首次成功地进行了肝基因疗法的临床试验，将低密度脂蛋白(LDL)受体的基因导入患家族性高胆固醇血症病人的肝脏，揭开了肝脏基因疗法的序幕。肝脏既可作为基因的生物反应器，又可以作为治疗靶，肝脏的基因治疗对肝炎、肝硬化、肝癌等疾病提供了新的治疗前景。腺病毒伴随病毒(AAV)属于细小病毒科，是一类病毒颗粒小、复制缺陷、无包膜的病毒，迄今尚未发现野生型AAV对人体致病。经人工改造的重组AAV(rAAV)具备安全性好、免疫原性低、组织嗜性广泛、不整合到宿主细胞基因组等优点，近年来，用rAAV作基因治疗载体已成为基因治疗研究的热点。重组AAV作为基因治疗载体也存在明显缺点，其装载外源基因的容量较小，单链基因组AAV装载外源基因的上限为4.7kb，装载外源基因长度的进一步增加，病毒颗粒包装的完整性随之下降。由于装载量的限制，一些较大的基因并不适合用rAAV载体进行递送，如A型血友病致病基因凝血因子Ⅷ，其cDNA大小为7056bp，编码2351aa的FⅧ前体蛋白，远超出rAAV的装载容量。针对凝血因子Ⅷ基因较大和AAV载体装载基因受容量限制等特点，LindP.,etal通过用14个氨基酸的衔接肽(SQ序列)替换凝血因子Ⅷ的B结构域(760-1667aa)，将该基因的大小降低40％至4.4kb(LindPetal.,Eur.J.Biochem.232:19-27,1995)，该BdomaindeletedFⅧ(BDD-FⅧ)是目前FⅧ蛋白表达较常采用的版本；JennyMcIntosh.,etal通过在SQ序列中间插入包含6个糖基化位点的17aa短肽V3(V3-FⅧ)来增强该蛋白在体内表达(JennyMcIntoshetal.,BLOOD.121(17)，2013)。但无论是BDD-FⅧ还是V3-FⅧ，其尺寸已经接近rAAV的装载上限，留给调控目的基因表达的调控元件(启动子、PolyA)只有大约300bp的空间。FⅧ的主要合成场所是肝细胞和肝窦内皮细胞，目前使用rAAV基因治疗血友病A的策略是在缩小目的基因FⅧ的同时，采用小尺寸的肝脏特异性启动子，将启动子、BDD-FⅧ或V3-FⅧ、polyA组装到同一AAV载体有限的空间上，如BIOMARIN公司的BMN270的表达簇为HLP-BDDFⅧ-sPA(ClinicalTrials.govnumber,NCT02576795)，SPARK公司的SPK-8011的表达簇为TTRm-BDDFⅧ-RabbitbetaglobinpolyA(ClinicalTrials.govnumber,NCT03003533)，两者均采用的是小尺寸的肝脏特异性启动子驱动目的基因的表达，Ⅰ/Ⅰ期临床试验已经取得了一定的效果(RangarajanSetal.,TheNewEnglandjournalofmedicine.2017；LindseyA.Getal.,Blood.130:604,2017)，其中BIOMARIN的血友病A基因治疗药物BMN270已向EMA提交上市申请。但由于启动子尺寸制约，其启动强度与一些较大尺寸启动子之间还是存在着不小的差距。一个高效的启动子能够持续高强度的启动目的基因的表达，降低达到治疗效果所需剂量，降低给药次数，从而大大降低了治疗成本和机体的免疫反应。目前广泛为大家熟知的肝脏特异性启动子为TBG启动子(Humanthyroxinebindingglobulinpromoter，人甲状腺素结合球蛋白启动子，Bishetal.,2011；Carrillo-Carrascoetal.,2010；Cotugnoetal.,2011；Gaoetal.,2002)。但是该启动子在肝脏中的启动强度并不理想，表达水平并不高(CN111218446A)。因此，以TTR启动子(Transthyretinpromoter，甲状腺素转载蛋白启动子)以及hAAT启动子(Humanα1-antitrypsinpromoter，人抗胰蛋白酶α1启动子)为基础的各种改造的新的启动子被运用在血友病A以及血友病B的基因治疗项目中，这些启动子包括TTRm启动子(SPARK公司spark-8011项目中突变后TTR启动子，ClinicalTrials.govnumber，NCT03003533)、ApoE-HCR-hAAT启动子(US7351813B2)、HLP启动子(BIOMARIN公司BMN270项目中启动子，ClinicalTrials.govnumber，NCT02576795)、CRM8/TTRp/MVM(小鼠TTR启动子区域后添加MVM内含子，启动子区域前添加CRM8增强序列，sangoma公司SB525项目中启动子，ClinicalTrials.govnumber,NCT03061201)、TTRe/TTRp/MVM(小鼠TTR增强子区域和启动子区域后添加MVM内含子，WuZhijianetal.,2009)、ATh1-5系列启动子(CN111218446A)。由于rAAV装载容量限制，装载诸如凝血因子Ⅷ等较大基因时，势必要缩减启动子的长度，与之相对应的是，删除序列中所包含的关键表达调控元件也随之丢失，目的基因的表达强度和特异性也会随之下降。如何在最大程度缩减启动子尺寸的情况下，仍然维持启动子启动目的基因的强度和特异性，是采用rAAV作为载体递送较大基因时需要解决的重要问题。纵观以上改造后的肝脏启动子，基本上都是围绕以TTR和hAAT作为核心进行改造。因此，很难在维持较小尺寸的条件下改造出表达强度非常强的启动子。如何跳出现有改造的桎梏，筛选出更优表达强度更强的小尺寸启动子，从而解决采用rAAV作为载体递送较大基因时的痛点，是本专利技术需要解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷或改进需求，本专利技术的目的在于提供尺寸小且表达强度高的肝脏特异性启动子，并将其应用于驱动较大的外源基因表达(如FVIII凝血因子基因)，由此解决现有基因治疗所用rAAV载体存在装载容量有限、现有肝脏特异性启动子表达强度欠佳的技术问题。为实现上述目的，本专利技术提供了一种重组核酸分子，其包括：(a)与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第一多核苷酸，或该第一多核苷酸的功能片段；该重组核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。优选地，该重组核酸分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组核酸分子，其特征在于，其包括：/n(a)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第一多核苷酸，或该第一多核苷酸的功能片段；/n该重组核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组核酸分子，其特征在于，其包括：
(a)与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第一多核苷酸，或该第一多核苷酸的功能片段；
该重组核酸分子能够促进异源多核苷酸在哺乳动物肝脏组织的转录。


2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其特征在于，该重组核酸分子还包括：
(b)与SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第二多核苷酸，或该第二多核苷酸的功能片段；
其中(b)和(a)5’-3’连接。


3.如权利要求2所述的重组核酸分子，其特征在于，该重组核酸分子还包括：
(c)与SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示的核苷酸序列具有至少90％核酸序列同一性的第三多核苷酸，或该第三多核苷酸的功能片段；
其中(c)、(b)和(...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘杏，刘光猛，张胜，方文晶，何晓斌，
申请(专利权)人：武汉枢密脑科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42