一种高效的腺相关病毒制备系统及方法技术方案

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种高效的腺相关病毒制备系统及方法，该系统包括能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系、携带部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒以及携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒；产生重组腺相关病毒所必需的元件包括Cap基因、Rep基因和带有外源基因的AAV核心表达元件；重组腺病毒的基因组中缺失E1和E3基因，且部分产生重组腺相关病毒所必需的元件插入于E1基因和/或E3基因所在区域，重组腺病毒的包装信号Ψ两端均同向插入有一段loxp序列。利用本发明专利技术系统制备AAV，相比传统三质粒系统，能显著提高AAV的产量和纯度，提高整体系统的稳定性和生物安全性。体系统的稳定性和生物安全性。体系统的稳定性和生物安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种高效的腺相关病毒制备系统及方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，更具体地，涉及一种高效的腺相关病毒制备系统及方法。

技术介绍

[0002]目前基于三质粒(AAV
‑
ITR、AAV
‑
RC、Helper)系统，转染293细胞制备腺相关病毒(AAV)的方法存在诸多问题，例如首先，无论AAV悬浮或者贴壁细胞生产AAV的产量普遍在109～10
10
vg/mL之间，这种产量难以满足基因治疗需要的量，因此现行的AAV基因疗法价格十分昂贵；其次，基于三质粒转染系统的大规模制备AAV时，需要同时制备三个质粒DNA，大规模质粒制备可能存在诸多问题，而且不同批次制备的质粒质量也存在不同，极大影响AAV的产率，也增加了AAV制备的成本。尽管目前使用的BAC
‑
sf9系统制备AAV能够获得较高的产量，但是由于制备过程中使用了昆虫细胞，在AAV的制备过程中可能引入异源物种的基因，导致基因治疗潜在的风险，而且杆状病毒基因组极其不稳定，也极大地增加了AAV制备的不确定性。
[0003]因此，有必要开发出一种新的高效的AAV制备系统，能够极大提高AAV的产量，提高整体系统的稳定性及生物安全性。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种高效的腺相关病毒制备系统及方法，提高AAV的产量和纯度，避免异源物种基因的引入，同时提高制备系统的稳定性。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种高效的重组腺相关病毒制备系统，其包括能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系、携带部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒以及携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒；
[0006]所述产生重组腺相关病毒所必需的元件包括AAVCap基因、AAVRep基因和带有外源基因的AAV核心表达元件ITR
‑
GOI；
[0007]所述重组腺病毒的基因组中缺失E1基因和E3基因，且所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件插入于所述E1基因和/或所述E3基因所在区域，所述重组腺病毒的包装信号Ψ的两端各插入有一段loxp序列，两段所述loxp序列同向。
[0008]优选地，所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件为AAVRep基因和AAVCap基因，所述其它产生重组腺相关病毒所必需的元件为带有外源基因的AAV核心表达元件ITR
‑
GOI。
[0009]按照本专利技术的另一方面，还提供了一种高效的重组腺相关病毒制备方法，其包括如下步骤：
[0010]S1、分别构建能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系、携带部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒以及携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒；
[0011]所述产生重组腺相关病毒所必需的元件包括AAVCap基因、AAVRep基因和带有外源基因的AAV核心表达元件ITR
‑
GOI；
[0012]所述重组腺病毒的基因组中缺失E1基因和E3基因，且所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件插入于所述E1基因和/或所述E3基因所在区域，所述重组腺病毒的包装信号Ψ的两端各插入有一段loxp序列，两段所述loxp序列同向；
[0013]S2、将所述携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒转染所述能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系，然后用所述重组腺病毒感染转染后的能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系，培养得到含有重组腺相关病毒的病毒液；
[0014]S3、纯化所述含有重组腺相关病毒的病毒液，去除其中的腺病毒，得到纯的重组腺相关病毒。
[0015]优选地，步骤S1中，所述能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系采用质粒转染或慢病毒的方式进行构建。
[0016]进一步优选地，所述能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系的构建方法包括：将携带Cre基因的重组慢病毒质粒转染293T细胞，用嘌呤筛选得到阳性单克隆细胞系；
[0017]在所述重组慢病毒质粒中，所述Cre基因上游含有核定位序列。
[0018]进一步优选地，所述能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系的构建方法还包括：将感染复数在1～100范围内的等量的所述重组腺病毒分别感染筛选得到的各所述阳性单克隆细胞系，感染48h后，挑选出维持好的状态的细胞系，作为用于制备重组腺相关病毒的293T细胞系。
[0019]优选地，步骤S1中，所述重组腺病毒的构建方法包括：在腺病毒穿梭质粒中的包装信号Ψ的两端各插入一段所述loxp序列，并在所述腺病毒穿梭质粒中插入所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件，得到重组穿梭质粒；将所述重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒一起电转化BJ5183感受态细胞，通过同源重组获得重组腺病毒质粒；将所述重组腺病毒质粒转染293细胞，拯救出能够表达所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒。
[0020]优选地，步骤S2中，所述重组腺病毒的感染复数为10～20。
[0021]优选地，步骤S3中，纯化所述含有重组腺相关病毒的病毒液的方法包括通过氯仿抽提及碘克沙醇密度梯度离心。
[0022]优选地，所述重组腺相关病毒制备方法用于制备AAV血清1型、2型、5型、8型、9型或PHPeB型。
[0023]总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0024](1)本专利技术提供的腺相关病毒制备系统，相对于纯靠质粒转染制备AAV(例如三质粒系统)而言，腺病毒能100％感染293T细胞，而悬浮细胞转染效率一般在50％～70％左右，也就是说会有30％～50％的细胞未能被携带产生重组腺相关病毒所必需的元件的质粒转染而不生产AAV，同时由于这些细胞没有负载质粒，会在培养基中保持更高活力，快速扩增，消耗大量的营养物质，而且会吸附大量新生的AAV粒子，进一步降低了最终AAV的产量。而本专利技术提供的制备腺相关病毒的方法，使用腺病毒感染，100％的293T细胞被感染，新生的AAV粒子进入未被转染表达质粒的细胞中，可以在腺病毒的辅助下开始重组腺相关病毒扩增，
从而提高AAV最终产量。同时，由于重组腺病毒中利用Cre/loxp系统可在生产rAAV过程中抑制腺病毒的扩增，进一步提高AAV的纯度。利用本专利技术系统制备的AAV产量可达到10
12
vg/mL以上，相对传统的三质粒系统可提高100倍以上。
[0025](2)三质粒系统的RC质粒和helper质粒，相当于直接由本专利技术中的重组腺病毒提供，由于腺病毒具有高效感染293系列细胞特性，可以使细胞达到100％感染，因此能够高表达腺病毒携带的AAV的Rep
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Cap基因，同时腺病毒自身存在helper质粒所有基因。
[0026](3)本专利技术提供的重组腺相关病毒制备方法，相比于传统的三质粒制备系统，不需要同时制备三个质粒，只需要制备一个质粒即可，极大地本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效的重组腺相关病毒制备系统，其特征在于：包括能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系、携带部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒以及携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒；所述产生重组腺相关病毒所必需的元件包括AAVCap基因、AAVRep基因和带有外源基因的AAV核心表达元件ITR
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GOI；所述重组腺病毒的基因组中缺失E1基因和E3基因，且所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件插入于所述E1基因和/或所述E3基因所在区域，所述重组腺病毒的包装信号Ψ的两端各插入有一段loxp序列，两段所述loxp序列同向。2.根据权利要求1所述的高效的重组腺相关病毒制备系统，其特征在于：所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件为AAVRep基因和AAVCap基因，所述其它产生重组腺相关病毒所必需的元件为带有外源基因的AAV核心表达元件ITR
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GOI。3.一种高效的重组腺相关病毒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、分别构建能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系、携带部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒以及携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒；所述产生重组腺相关病毒所必需的元件包括AAVCap基因、AAVRep基因和带有外源基因的AAV核心表达元件ITR
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GOI；所述重组腺病毒的基因组中缺失E1基因和E3基因，且所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件插入于所述E1基因和/或所述E3基因所在区域，所述重组腺病毒的包装信号Ψ的两端各插入有一段loxp序列，两段所述loxp序列同向；S2、将所述携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒转染所述能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系，然后用所述重组腺病毒感染转染后的能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系，培养得到含有重组腺相关病毒的病毒液；S3、纯化所述含有重组腺相关病毒的病毒液，去除...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗振，冯诚，奚源，杨小豪，
申请(专利权)人：武汉枢密脑科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：