一种高效的腺相关病毒制备系统及方法技术方案

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种高效的腺相关病毒制备系统及方法，该系统包括能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系、携带部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒以及携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒；产生重组腺相关病毒所必需的元件包括Cap基因、Rep基因和带有外源基因的AAV核心表达元件；重组腺病毒的基因组中缺失E1和E3基因，且部分产生重组腺相关病毒所必需的元件插入于E1基因和/或E3基因所在区域，重组腺病毒的包装信号Ψ两端均同向插入有一段loxp序列。利用本发明专利技术系统制备AAV，相比传统三质粒系统，能显著提高AAV的产量和纯度，提高整体系统的稳定性和生物安全性。体系统的稳定性和生物安全性。体系统的稳定性和生物安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种高效的腺相关病毒制备系统及方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，更具体地，涉及一种高效的腺相关病毒制备系统及方法。

技术介绍

[0002]目前基于三质粒(AAV
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ITR、AAV
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RC、Helper)系统，转染293细胞制备腺相关病毒(AAV)的方法存在诸多问题，例如首先，无论AAV悬浮或者贴壁细胞生产AAV的产量普遍在109～10
10
vg/mL之间，这种产量难以满足基因治疗需要的量，因此现行的AAV基因疗法价格十分昂贵；其次，基于三质粒转染系统的大规模制备AAV时，需要同时制备三个质粒DNA，大规模质粒制备可能存在诸多问题，而且不同批次制备的质粒质量也存在不同，极大影响AAV的产率，也增加了AAV制备的成本。尽管目前使用的BAC
‑
sf9系统制备AAV能够获得较高的产量，但是由于制备过程中使用了昆虫细胞，在AAV的制备过程中可能引入异源物种的基因，导致基因治疗潜在的风险，而且杆状病毒基因组极其不稳定，也极大地增加了AAV制备的不确定性。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效的重组腺相关病毒制备系统，其特征在于：包括能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系、携带部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒以及携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒；所述产生重组腺相关病毒所必需的元件包括AAVCap基因、AAVRep基因和带有外源基因的AAV核心表达元件ITR
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GOI；所述重组腺病毒的基因组中缺失E1基因和E3基因，且所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件插入于所述E1基因和/或所述E3基因所在区域，所述重组腺病毒的包装信号Ψ的两端各插入有一段loxp序列，两段所述loxp序列同向。2.根据权利要求1所述的高效的重组腺相关病毒制备系统，其特征在于：所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件为AAVRep基因和AAVCap基因，所述其它产生重组腺相关病毒所必需的元件为带有外源基因的AAV核心表达元件ITR
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GOI。3.一种高效的重组腺相关病毒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、分别构建能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系、携带部分产生重组腺相关病毒所必需的元件的重组腺病毒以及携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒；所述产生重组腺相关病毒所必需的元件包括AAVCap基因、AAVRep基因和带有外源基因的AAV核心表达元件ITR
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GOI；所述重组腺病毒的基因组中缺失E1基因和E3基因，且所述部分产生重组腺相关病毒所必需的元件插入于所述E1基因和/或所述E3基因所在区域，所述重组腺病毒的包装信号Ψ的两端各插入有一段loxp序列，两段所述loxp序列同向；S2、将所述携带其它产生重组腺相关病毒所必需的元件的表达质粒转染所述能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系，然后用所述重组腺病毒感染转染后的能够稳定表达Cre重组酶的293T细胞系，培养得到含有重组腺相关病毒的病毒液；S3、纯化所述含有重组腺相关病毒的病毒液，去除...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗振，冯诚，奚源，杨小豪，
申请(专利权)人：武汉枢密脑科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：