一种表达载体、重组腺相关病毒及其在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体公开了一种表达载体、重组腺相关病毒及其在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用，该表达载体包括目的基因表达盒和位于所述目的基因表达盒两端的腺相关病毒反向末端重复序列，所述目的基因表达盒包含从5

【技术实现步骤摘要】
一种表达载体、重组腺相关病毒及其在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，更具体地，涉及一种表达载体、重组腺相关病毒及其在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒(Coronavirus)是一类有包膜的单股正链RNA病毒，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。目前共发现7种可以感染人的冠状病毒，分别是人冠状病毒229E (HCoV
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229E)、人冠状病毒OC43(HCoV
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OC43)、人冠状病毒NL63(HCoV
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NL63)、香港I型人冠状病毒(HCoV
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HKU1)、严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS
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CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS
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CoV)及2019新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)。其中，SARS
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CoV、 MERS
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CoV和SARS
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CoV
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2是目前发现的人高致病性冠状病毒，给人类健康带来了极大危害。
[0003]2019新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)具有高传染性和高隐蔽性，感染病毒的人会出现不同程度的症状，包括轻症样的发烧或轻微咳嗽，或是重症样的肺炎，而更为严重的甚至造成患者死亡。目前全世界对于新冠疫情的防控主要在于通过隔离消毒等措施，控制向未感染人群的传播，同时接种新型冠状病毒预防性疫苗。目前全球获批紧急使用的新型冠状病毒预防性疫苗包括：(1)新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)(厂家：国药北京生物、国药武汉生物、北京科兴生物、康泰生物)；(2)腺病毒载体新冠疫苗(厂家：康希诺Ad5、强生 Ad26、阿斯利康Ad26、Gamaleya Ad5+Ad26)；(3)mRNA新冠疫苗(厂家：辉瑞、Moderna)； (4)重组蛋白新冠疫苗(厂家：智飞龙科马、Novavax)。
[0004]目前获批紧急使用的新型冠状病毒疫苗各有其优劣。
[0005]灭活疫苗是使用直接灭活的新型冠状病毒作为抗原对人体进行免疫，从而产生抗体，是我国使用最广泛的疫苗，科兴、国药疫苗均为灭活疫苗。这类疫苗技术十分成熟，发展较早，其优势在于：极高的安全性，很低的不良反应几率，方便的储存条件；劣势为：有效率较低，生产周期长，有时会引起抗体依赖性增强效应(antibody dependent enhancement，ADE)，加重病毒感染。
[0006]腺病毒载体疫苗：目前有阿斯利康疫苗、俄罗斯疫苗、强生疫苗、康希诺疫苗为腺病毒载体疫苗。该疫苗优势在于：生产速度快，适用于突发重大流行病，有效率高；劣势在于：安全性差，不良反应率极高。这种不良反应主要是源自人体对腺病毒的强烈免疫反应，目前已出现几例由该不良反应引发的死亡案例。
[0007]mRNA疫苗：辉瑞、Moderna疫苗均为mRNA疫苗，也是目前美国所采用的主流疫苗。其机理为通过修饰抗原决定簇的编码mRNA使其不具备较强的炎症激活能力，在被细胞吸收后，在宿主细胞内表达抗原决定簇，使得免疫系统识别该宿主细胞表达的抗原后产生细胞免疫抗体，从而杀灭病毒。但RNA疫苗载体本身具有一定的免疫原性，外源性核酸感染细胞时会引起后者炎症活化，从而使得大量RNA被降解。该疫苗优势为：有效率高，免疫持续时间长，生产速度快；缺点为：储存条件严苛，技术门槛高，多数国家无法大规模生产，安全性低
于灭活疫苗。
[0008]重组蛋白新冠疫苗：智飞龙科马和Novavax疫苗为此类型疫苗。重组蛋白疫苗需要辅助使用佐剂激活人体的免疫应答，而佐剂的选择对疫苗副作用的产生具有较大影响，同时由于蛋白质稳定性的问题，生物体无法长期持续性产生抗体。优势为：安全性仅次于灭活疫苗，生产速度较快，有效率高；缺点为：需要多次免疫，如智飞龙科马的重组疫苗需要免疫三针。
[0009]腺相关病毒(adeno
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associated virus，AAV)是一类小的、复制缺陷的、无包膜的病毒，属于细小病毒科，由于AAV存在安全性好(迄今从未发现野生型AAV对人体致病)、免疫原性低、能感染分裂细胞和非分裂细胞、重组AAV不整合到宿主细胞基因组等优点，近年来，用AAV作基因治疗载体已成为基因治疗研究的热点。目前美国以及欧洲均已批准腺相关病毒的临床药物上市，有大量临床案例辅助证实了其安全性。
[0010]目前基于重组AAV的新冠疫苗相较于其他种类疫苗研究较少，缺乏AAV新冠疫苗的长效性研究，迫切需要开发一种针对预防新型冠状病毒SARS
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CoV
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2具有长效性、稳定性强的AAV载体疫苗。

技术实现思路

[0011]针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种表达载体、重组腺相关病毒及其在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用，通过在双链AAV的表达载体中插入TPA分泌信号肽编码序列连接的RBD基因，以实现新型冠状病毒RBD蛋白在动物机体内的高效、稳定地、长期地的分泌表达。
[0012]为实现上述目的，本专利技术提供了一种表达冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域的表达载体，其包括目的基因表达盒和位于所述编码区两端的AAV反向末端重复序列，所述目的基因表达盒包含从5
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至3
’
的、可操作连接的启动子、编码TPA分泌信号肽的核苷酸序列及编码冠状病毒RBD的核苷酸序列，所述表达载体用于制备重组双链腺相关病毒。
[0013]优选地，所述启动子为CBh启动子、CMV启动子、CAG启动子或CBA启动子。
[0014]优选地，所述启动子为CBh启动子。
[0015]优选地，所述编码冠状病毒RBD的核苷酸序列经过人源密码子优化。
[0016]优选地，所述冠状病毒为2019新型冠状病毒，所述编码冠状病毒RBD的核苷酸序列如 SEQ ID No.2所示。
[0017]优选地，所述编码冠状病毒RBD的核苷酸序列的3
’
端可操作连接有编码靶向肽的核苷酸序列，所述靶向肽为MHC2受体结合结构域。
[0018]按照本专利技术的另一方面，提供了一种表达冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域的重组腺相关病毒，其由上述表达载体参与转染宿主细胞而制得。
[0019]优选地，所述重组腺相关病毒为双链AAV。
[0020]优选地，所述重组腺相关病毒的衣壳蛋白为AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或 AAV9血清型衣壳蛋白。
[0021]优选地，所述重组腺相关病毒的衣壳蛋白为AAV6或AAV9血清型衣壳蛋白。
[0022]按照本专利技术的另一方面，提供了一种重组腺相关病毒的制备方法，其包括如下步骤：将上述表达载体、辅助质粒pHelper和血清型质粒pRepCap共孵育，在转染试剂聚乙烯亚
胺存在的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域的表达载体，其特征在于：包括目的基因表达盒和位于所述目的基因表达盒两端的腺相关病毒反向末端重复序列，所述目的基因表达盒包含从5
’
至3
’
的、可操作连接的启动子、编码TPA分泌信号肽的核苷酸序列及编码冠状病毒RBD的核苷酸序列，所述表达载体用于制备重组双链腺相关病毒。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述启动子为CBh启动子、CMV启动子、CAG启动子或CBA启动子。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述编码冠状病毒RBD的核苷酸序列经过人源密码子优化。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述冠状病毒为2019新型冠状病毒，所述编码冠状病毒RBD的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。5.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：武汉枢密脑科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：