携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种携带猪肺炎支原体P216基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，将肺炎支原体P216基因插入骨架质粒中，形成携带目的基因的重组腺相关病毒DNA载体质粒，将重组腺相关病毒DNA载体质粒、可提供AAV2的复制蛋白和AAV5的外壳蛋白的包装质粒与辅助质粒共转染宿主细胞，进而获得携带P216基因的重组5型腺相关病毒载体rAAV5

【技术实现步骤摘要】
携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
中的重组病毒载体及应用，特别是涉及一种携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体及其构建方法，与其在制备抗猪肺炎支原体感染及预防相关疾病的疫苗或药物中的应用。

技术介绍

[0002]猪气喘病或猪喘气病，又称猪支原体肺炎，是由支原体科猪肺炎支原体引起的一种接触性、慢性、消耗性呼吸道传染疾病。患有该病的病猪多表现为食欲不振，致使饲料整体利用率降低，减缓猪的生长速度，不仅延长了育肥饲养期，还增加了饲养成本，对养殖场来说利益受到了严重损害。但猪气喘病的潜伏期较长，大多数猪在感染该病后不会表现出特别明显的症状，很难被及时发现，因此整个猪群受到感染的容易度较高。
[0003]猪支原体肺炎具有发病率高、致死率低的特点，属于慢性疾病的范畴，虽然危害性大，但对于猪个体成活率的直接影响较小，加上目前养殖过程中需要的烈性疾病的免疫种类已经很多了，很多猪场管理者很难再预留出时间来接种用于预防该疾病的传统疫苗，因此存在忽视该疾病的情况。因此，寻求一种使用方便且有明显预防或治疗效果的抗猪肺炎支原体感染的药物十分紧迫。
[0004]腺相关病毒(Adeno
‑
AssociatedVirus，AAV)属于微小病毒科，依赖病毒属，是一种非致病性的缺陷型病毒，在复制时需要其他病毒(如腺病毒)的基因产物参与辅助，进而表现出感染性。AAV的颗粒直径在20～26nm之间，含有4.7kb大小的线状单链DNA基因组，基因组的两端为反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeats，ITR)，包含了复制、包装、拯救及整合的信号，中间为病毒的结构基因，包括与病毒复制有关的Rep基因和病毒包膜Cap基因。通过将外源基因导入AAV以及适当删除部分结构基因以增大外源性基因的容量，可形成具有感染性的重组腺相关病毒(recombinant Adeno
‑
Associated Virus，rAAV)，其能介导外源基因长期稳定表达，具有生物安全性好、无致病性、免疫原性低、物理性质稳定、宿主细胞范围广的优点，被视为最有前途的基因治疗载体之一，成为目前基因治疗载体研究的热点。
[0005]但在本行业内，目前暂未将重组5型腺相关病毒载体技术用于预防或治疗猪肺炎支原体性疾病。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种实用性好的携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体，通过将目的基因猪肺炎支原体P216基因插入5型腺相关病毒载体中，获得携带P216基因的重组5型腺相关病毒载体rAAV5
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P216，所述P216基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]优选地，所述rAAV5
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P216采用三质粒共转染法制备得到，所用的三质粒包括基因
携带载体质粒、包装质粒和辅助质粒，所述基因携带载体质粒是将外源基因的表达单位(通常由转录启动子、目的基因和多聚腺苷酸序列组成)插入骨架质粒中，所述骨架质粒携带AAV的ITR序列，所述包装质粒携带5型AAV的Cap基因和2型AAV的Rep基因，所述辅助质粒携带腺病毒的E2a、E4orf6和VA RNA基因。
[0008]通常来说，根据包装质粒Cap蛋白的不同，可以将重组腺相关病毒分为10个以上的基因型，不同基因型对不同组织器官细胞的亲和性存在差别，如：AAV1对肌肉、心脏、骨骼肌等神经组织等的亲和力强；AAV2对中枢神经、肌肉、肝脏、脑组织和眼等亲和力强；AAV3对肌肉、肝脏、肺和眼等亲和力强；AAV4对中枢神经、肌肉、眼和脑等亲和力强；AAV5对肺、眼、中枢神经、关节滑膜和胰腺等亲和力强；AAV6对肺和心脏等亲和力强；AAV7则对肌肉和肝脏等亲和力强等等。
[0009]因为猪肺炎支原体主要感染部位是动物的肺部，因此，本专利技术中针对性地选择了5型Cap蛋白和2型Rep蛋白的腺相关病毒包装质粒，构建了猪肺炎支原体P216基因的重组rAAV5
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P216病毒。
[0010]优选地，所述骨架质粒为pAAV
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MCS、pAAV
‑
IRES
‑
hrGFP或pAAV
‑
CAG
‑
RFP；所述包装质粒为pAAV
‑
RC5，所述辅助质粒为pHelper。
[0011]本专利技术的另一目的在于提供一种关于上述携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0012]步骤1、将猪肺炎支原体P216基因插入骨架质粒中，形成携带P216基因的重组腺相关病毒DNA载体质粒；
[0013]步骤2、将重组腺相关病毒DNA载体质粒、包装质粒和辅助质粒共转染宿主细胞，在宿主细胞中，包装质粒提供AAV的Rep蛋白和Cap蛋白，Rep蛋白配合辅助质粒将含有外源基因表达单位的rAAV基因组从DNA载体质粒上表达出来，并加以复制，Cap蛋白将单链的rAAVDNA包装成感染性的复制缺陷型病毒颗粒。
[0014]优选地，所述宿主细胞为Hek293细胞、HeLa细胞或PAM细胞。更优选地，所述宿主细胞为Hek293细胞，因为Hek293细胞在用磷酸钙转染时的效率最高，磷酸钙转染相对于脂质体转染的原料来说，价格更低廉，适合工业化生产。
[0015]优选地，所述步骤1的过程为：对从猪体内提取出的DNA进行PCR扩增，筛选出含有目的基因的片段并与骨架质粒进行双酶切反应，连接后转化到感受态细胞中，测序正确的PCR阳性克隆即为重组腺相关病毒DNA载体质粒。
[0016]优选地，PCR扩增时所用的引物针对P216基因进行设计，其中，正向引物为5
’‑
CGT AGA TCT CCA CCA TGG TCT CAA CTT TTG GTT CAA TAA TC
‑3’
，反向引物为5
’‑
CGC ACC GGT CTA AAA AGT TT CGG GCT TAA TA
‑3’
。
[0017]本专利技术还提供了一种抗猪肺炎支原体感染以及由肺炎支原体感染导致的疾病的疫苗或药物，所述疫苗或药物中的活性成分包括上述携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体。
[0018]优选地，所述疫苗或药物的剂型可采用粉剂、片剂或针剂。
[0019]本专利技术提供的技术方案至少具有如下有益效果：
[0020]本专利技术的重组腺相关病毒载体可将其携带的猪肺炎支原体的P216基因准确输送到动物的肺部表达目的蛋白，刺激集体产生免疫反应，具有靶向性、特异性、应激反应小或
者无应激反应等优点。实验证明，本专利技术提供的重组腺相关病毒载体对猪肺泡巨噬细胞具有极高的感染效率；同时，小鼠实验结果表明，只需要一次rAAV5
‑
P216注射就能达到P216重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体，其特征在于，是将目的基因猪肺炎支原体P216基因插入5型腺相关病毒载体中，获得携带P216基因的重组5型腺相关病毒载体rAAV5
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P216，所述P216基因的序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体，其特征在于，所述rAAV5
‑
P216采用三质粒共转染法制备得到，所用的三质粒包括基因携带载体质粒、包装质粒和辅助质粒，所述基因携带载体质粒是将外源基因的表达单位插入骨架质粒中，所述骨架质粒携带AAV的ITR序列，所述包装质粒携带5型AAV的Cap基因和2型AAV的Rep基因，所述辅助质粒携带腺病毒的E2a、E4orf6和VARNA基因。3.根据权利要求2所述的携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体，其特征在于，所述骨架质粒为pAAV
‑
MCS、pAAV
‑
IRES
‑
hrGFP或pAAV
‑
CAG
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RFP；所述包装质粒为pAAV
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RC5，所述辅助质粒为pHelper。4.一种如权利要求3所述的携带猪肺炎支原体P216基因的重组5型腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、将猪肺炎支原体P216基因插入骨架质粒中，形成携带P216基因的重组腺相关病毒DNA载体质粒；步骤2、将重组腺相关病毒DNA载体质粒、包装质粒和辅助质粒共转染宿主细胞，在宿主细胞中，包装质粒提供AAV的Rep蛋白和Cap蛋白，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大生，
申请(专利权)人：长沙爱科博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：