检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒和检测方法。本发明专利技术的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，包括PCV2引物、探针序列和PCV3引物、探针序列，同时还包含阴性对照，阳性对照，2X荧光PCR反应液和ddH2O。本发明专利技术参考临床检测到的PCV2和PCV3毒株，设计了检测PCV2和PCV3的引物和探针，并组装成试剂盒，几乎能扩增出所有已知的PCV2和PCV3毒株。本发明专利技术的双重荧光PCR试剂盒具有灵敏度高、特异性高和重复性好等特性，对于临床上进行PCV2和PCV3鉴别诊断具有重要意义。要意义。要意义。

【技术实现步骤摘要】
检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒（Porcine circovirus,缩写：PCV）是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有三个血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）的主要病原。该病最早于1991年在加拿大发现，并很快在欧美及包括我国在内亚洲国家发生和流行。除PMWS外，PDNS（猪皮炎与肾病综合征）、PNP（增生性坏死性肺炎）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2及其相关的猪病，死亡率为10%～30%不等，较严重的猪场在暴发该病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。PMWS已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。
[0003]2016年在美国发生急性死亡并伴有类似猪皮炎和肾病综合征临床症状且表现繁殖障碍的母猪体内分离出一种新型圆环病毒，猪圆环病毒3型（PCV3）。研究表明PCV3可能在繁殖障碍和猪皮炎和肾病综合征中起到一定的病原学上的作用。PCV3感染后在多种组织器官中广泛分布，较常见的病例变化的组织器官是心脏和肺脏的损伤。PCV3可导致类似PCV2感染发病的临床表现，如皮炎肾病综合征和母猪繁殖障碍，临床中要严格做好PCV2的疫苗免疫，且要加强PCV3的检测和监测。
[0004]PCV3是与PCV2遗传进化亲缘关系较远，且存在较大差异的新型猪圆环病毒，临床中PCV2疫苗无法对PCV3提供保护。因此对PCV2和PCV3鉴别诊断非常重要。
[0005]目前，PCV2的检测有国标GB/T 34745
‑
2017和GB/T 35901
‑
2018，但经过分析，很多优势的PCV2病毒毒株都无法用GB/T 34745
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2017和GB/T 35901
‑
2018的引物和探针检测出来。比如：GB/T 34745
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2017和GB/T 35901
‑
2018，都无法扩增NCBI号为MK015043的PCV2序列。同样，很多NCBI号（FJ644927和MW051676等）的PCV2毒株也无法用现有公布的专利（专利号CN202111401011）号PCV2检测试剂检测出来。专利号CN201010271159.9一样存在上述类似的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒。
[0007]根据本专利技术具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括PCV2引物、探针序列和PCV3引物、探针序列，其中，PCV2引物序列：SEQ ID NO.1: 5
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TCCTCCCGCCATACCATAAC
ꢀ‑3’
；SEQ ID NO.2: 5
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CGAACGCAGTGCCGAGGCCTAC
ꢀ‑3’
；
PCV2探针序列：SEQ ID NO.3: 5
’‑ꢀ
CAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGSTA
ꢀ‑3’
；PCV3引物序列：SEQ ID NO.5：5
’‑ꢀ
AGACCCCGCCCAAGGA
ꢀ‑3’
；SEQ ID NO.6：5
’‑ꢀ
GAAGTGGTTGGCGTGCCAGGGCTT
ꢀ‑3’
；PCV3探针序列SEQ ID NO.7：5
’‑ꢀ
ACGACGCCACAGAAGGCGCTATGYC
ꢀ‑3’
。
[0008]所述探针的5
’
端标记荧光基团，3
’
端标记淬灭基团，其中，荧光基团可选 FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas等，本专利技术的优选方案为FAM、ROX；淬灭基团可选TAMRA、BHQ（BHQ1、BHQ2、BHQ3）、MGB等，本专利技术的优选方案为BHQ1、BHQ2。
[0009]具体的，PCV2探针序列为：Fam
‑5’‑ꢀ
CAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGSTA
ꢀ‑3’‑
BHQ1；PCV3探针序列：ROX
‑5’‑ꢀ
ACGACGCCACAGAAGGCGCTATGYC
ꢀ‑3’‑
BHQ2。
[0010]根据本专利技术具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，引物和探针的浓度比为1
‑
5：1；其中，引物浓度为100
‑
200nM，探针浓度为20
‑
200 nM。
[0011]根据本专利技术具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，所述试剂盒还包含阴性对照、阳性对照、2X荧光PCR反应液和ddH2O。
[0012]其中，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O。
[0013]根据本专利技术具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，所述阳性对照为质粒或假病毒，并且所述阳性对照包含PCV2扩增产物序列、PCV3扩增产物序列。
[0014]其中，所述PCV2阳性对照序列如SEQ ID NO.4所示：TCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGGCTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCG；所述PCV3阳性对照序列如SEQ ID NO.8所示：ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGGCGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGTCAGAAGAAAACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAACGTCATTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAACGAATGGGAAAC。
[0015]根据本专利技术具体实施方式的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，所述质粒为pUC57，所述假病毒类型MS2噬菌体或重组腺病毒中的一种。
[0016]根据本专利技术具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCV2引物、探针序列和PCV3引物、探针序列，其中，PCV2引物序列：SEQ ID NO.1: 5
’‑
TCCTCCCGCCATACCATAAC
‑3’
；SEQ ID NO.2: 5
’‑
CGAACGCAGTGCCGAGGCCTAC
‑3’
；PCV2探针序列：SEQ ID NO.3: 5
’‑
CAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGSTA
‑3’
；PCV3引物序列：SEQ ID NO.5：5
’‑
AGACCCCGCCCAAGGA
‑3’
；SEQ ID NO.6：5
’‑
GAAGTGGTTGGCGTGCCAGGGCTT
‑3’
；PCV3探针序列SEQ ID NO.7：5
’‑
ACGACGCCACAGAAGGCGCTATGYC
‑3’
。2.根据权利要求1所述的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，其特征在于，引物和探针的浓度比为1
‑
5:1；其中，引物浓度为100
‑
200nM，探针浓度为20
‑
200nM。3.根据权利要求1所述的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阴性对照、阳性对照、2X荧光PCR反应液和ddH2O。4.根据权利要求3所述的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O。5.根据权利要求3所述的检测猪PCV2和PCV3的双重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为质粒或假病毒，并且所述阳性对照包含PCV2扩增产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚自冶，唐威，张大生，苏建，
申请(专利权)人：长沙爱科博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：