重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量测定方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及重组腺相关病毒载体样品中rcAAV含量的检测方法，所述方法的特征在于：使用4至5mL容量的细胞培养瓶培养细胞并在不损失rcAAV的情形下对细胞进行三轮或以上感染，然后使用SEQ ID NO:1和2所示的rep2基因特异性引物和SEQ ID NO:3所示的Taqman探针对第一轮和最后一轮的感染收获的超滤浓缩液实施定量PCR检测，由此获得重组腺相关病毒载体样品中rcAAV含量。本发明专利技术还涉及用于实施本发明专利技术的重组腺相关病毒载体样品中rcAAV含量的检测方法的试剂盒。法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量测定方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及重组腺相关病毒载体制品的质量检测领域。具体而言，本专利技术涉及重组腺相关病毒(adeno
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associated virus，AAV)载体制品中rcAAV含量的测定方法以及用于测定rcAAV含量的检测试剂盒。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(adeno
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associated virus，AAV)载体无致病性，免疫原性低，安全性好，能转导种类众多的组织细胞，并能长期稳定地表达其携带的基因，这些特性使其十分适合于作为体内基因转移的工具。重组腺相关病毒(recombinant AAV，rAAV)载体是一种具有高靶向性和良好安全性的病毒载体，在基因治疗中得到了较为广泛的应用。
[0003]目前构建重组AAV载体通常使用目的基因替换野生型腺相关病毒基因组中的rep基因、cap基因，再将重组基因组包装到有感染性的病毒颗粒中。重组AAV载体通过AAV ITR与反式存在于辅助成分或生产细胞中的rep基因和cap基因序列之间的同源或非同源重组的机制，在重组AAV载体生产期间可能形成复制型腺相关病毒(Replication Competent AAV,rcAAV)。近期的动物实验表明，rcAAV中cap基因在体内的表达会引发严重的免疫反应，且包装有其他DNA杂质的rcAAV还具有致瘤性或引入抗生素抗性的潜在风险。因此，重组AAV载体生产的组件应设计为可以消除rcAAV产生的可能，并且临床使用的rAAV载体产品需要对rcAAV进行检测，以严格控制rAAV载体制品中rcAAV的污染。
[0004]rcAAV作为rAAV载体制品生产过程中的产品相关杂质，对其限度尚未有明确的标准要求。重组AAV
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2/人凝血因子IX注射液质量标准中规定：在1E+06vg的rAAV
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hFIX中，rcAAV颗粒数(即，基因组拷贝数)不超过1个，检测方法为PCR法(《生物技术药物研究开发和质量控制(第三版)》)。
[0005]随着基因治疗技术的发展，研究者开发出qPCR法检测rcAAV基因组拷贝数，但是qPCR法扩增的rcAAV基因组不一定具有复制或感染活性。因此qPCR法无法真正的确定rcAAV含量。此外，qPCR法检出限受rAAV制品浓度限制，无法检测低浓度rAAV制品中残余rcAAV基因组拷贝数，例如用于生产过程中对中间产品的质量控制。
[0006]对于AAV2血清型载体，可以使用感染中心测定法(infectious center assay)进行具有复制活性的rcAAV残余检测。由于大多数非AAV2血清型载体制品中的rcAAV观察到对于体外培养细胞的感染效率较低，开发非AAV2血清型载体制品中的rcAAV测定是一个挑战。
[0007]Wright和Zelenaia(“Vector Characterization Methods for Quality Control Testing of Recombinant Adeno
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Associated Viruses”，Viral Vectors for Gene Therapy，第11章，Otto
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Wilhelm Merten编著)公开了一种使用AAV2制品通过2轮细胞感染后，收集细胞上清液进行点杂交来检测AAV2制品中rcAAV含量的方法，该方法对rcAAV的检出限为1rcAAV/1E+06vg rAAV样品。具体地，该方法第一轮对HEK293细胞的感染在15
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100mm培养皿中进行，第二轮对HEK293细胞的感染在6孔板中进行。在需要加入新鲜培养基
补充细胞培养过程中的营养的情况下，加入的感染病毒液体体积有限，因此该方法第二轮感染材料为250μL第一轮收获上清液(其中，第一轮收获上清液共10mL)，仅为收获液体之体积的0.25％，使得rcAAV检出灵敏度有限。其用于检测rcAAV颗粒的点杂交法是将靶标DNA吸附结合到硝酸纤维膜或尼龙膜上后，采用标记的不同序列特异性探针与rcAAV插入的DNA片段杂交结合，最后通过荧光或显色的方式测定。由于杂交溶液中一些成分会干扰基因组DNA与硝酸纤维膜或尼龙膜结合等因素，导致其实验之间的差异性较高。
[0008]Allay J.A.等人(“Good Manufacturing Practice Production of Self
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Complementary Serotype 8Adeno
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Associated Viral Vector for a Hemophilia B Clinical Trial”，Human Gene Therapy，Vol.22,No.5，2011)公开了一种检测AAV8制品中rcAAV含量的方法：使用AAV8制品对293T细胞实施三轮感染，后收获上清液进行qPCR检测，该方法rcAAV检出限为1rcAAV/2.25E+06vg rAAV样品。所述方法自第二轮细胞感染起，使用的接种物为上一轮收获的培养物(共20mL)中的1mL细胞上清，仅占收获总液体的5％，接种至20mL新鲜培养基中。3轮感染结束后，最终收获上清液利用ArchivePure DNA分离试剂盒(5PRIME，Gaithersburg，MD)分离基因组DNA，后采用qPCR检测每一轮次样品中rcAAV浓度，并统计Ct值，绘制折线图，其中当Ct值有下降趋势时，认为检测到rcAAV。但该方法的检测过程中三个轮次的感染每次均损失95％rcAAV，并将该1mL收获的细胞上清加入20mL新鲜培养液中，使rcAAV浓度被稀释20倍，大大降低其在新一轮细胞感染中对细胞的感染效率，极大增加了假阴性检测结果的可能，导致检测灵敏度有限。另外，实施该方法的培养容器为15
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100mm培养皿，所需培养液体积较大，为20mL，这使得检测rcAAV的成本提高。
[0009]由于AAV9通过与细胞表面糖蛋白的天冬酰胺糖链上的末端半乳糖结合才能感染病入侵细胞，然而大多数体外培养的细胞类型只表达较少的末端半乳糖而高表达唾液酸残基，丰富的唾液酸残基对末端半乳糖起到遮蔽作用，这导致AAV9病毒体外感染细胞转导效率很差。现有技术中未有研究显示检测rAAV9制品中rcAAV9含量的方法。由于rAAV9对细胞的敏感性低于AAV8，更远低于AAV2，且qPCR法又无法区分具有复制能力的rcAAV9，因此检测rAAV9制品中rcAAV9含量一直是本领域的一个难题。
[0010]本领域急需要建立了一种检测重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量(尤其是rcAAV9含量)的测定方法以及用于测定rcAAV含量的检测试剂盒。

技术实现思路

[0011]本专利技术人通过研究，开发了一种检测重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量的高灵敏度检测方法。该方法能够通过qPCR法检测经多轮(例如，三轮、四轮或以上)感染后Ct值与第一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量检测方法，包括如下步骤：(1)使用约4至5mL容量的细胞培养瓶，例如T25培养瓶，培养细胞；(2)将以下各组接种物加入至分别的所述细胞培养瓶中，进行细胞的第一轮感染：i)阳性对照组(PC)：为辅助病毒和rcAAV标准品，其中，辅助病毒用于rcAAV标准品的复制，且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV，例如，1E+4vg，2E+4vg，4E+4vg，6E+4vg，8E+4vg，1E+5vg，2E+5vg rcAAV；ii)加标组(Spike)：为辅助病毒和rcAAV标准品，以及受检样品，其中，辅助病毒用于rcAAV标准品的复制，且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV，例如，1E+4vg，2E+4vg，4E+4vg，4E+4vg，6E+4vg，8E+4vg，1E+5vg，2E+5vg rcAAV；受检样品为约1E+08vg至1E+11vg AAV，例如，1E+08vg，1E+09vg，1E+10vg，1E+11vg AAV；iii)受检样品组(Test)：为辅助病毒和受检样品，其中，受检样品为约1E+08vg至1E+11vg AAV，例如，1E+08vg，1E+09vg，1E+10vg，1E+11vg AAV；(3)第一轮感染结束后，将所述各培养瓶中的细胞及上清冻融，并将各培养瓶中的全部细胞及上清转移至分别的离心管中，56℃灭活后，超滤浓缩至1mL；取约500μL浓缩液于≤
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70℃保存，用于qPCR检测；另约500μL浓缩液作为下一轮感染接种液；(4)将第一轮感染后获得的各约500μL浓缩液加入约4mL新鲜的培养基中，进行第二轮细胞感染，与步骤(3)同样地，各培养瓶获得1mL超滤浓缩液，全部用于下一轮感染；(5)第三轮感染(任选地，第四轮感染)与第二轮感染操作相同；在第三轮感染(任选地，第四轮感染)结束后，各培养瓶获得1mL超滤浓缩液全部用于qPCR检测；(6)完成三轮(任选地，四轮)感染后，自第一轮和最后一轮感染收获的超滤浓缩液提取DNA，作为实施qPCR的DNA模板，以Rep基因为模板设计特异性引物以及Taqman探针，进行qPCR检测；(7)结果分析及判定：如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值；加标组(Spike)：第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值；且受检样品组(Test)：第一轮Ct均值＜最后一轮Ct均值，则受检样品中rcAAV含量为：＜rcAAV标准品加入量/AAV样品加入量(vg)；如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值；加标组(Spike)：第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值；且受检样品组(Test)：第一轮Ct均值＞最后一轮Ct均值，则需进一步稀释受检样品并实施步骤(1)至(6)的检测，直至检测到受检样品组(Test)：第一轮Ct均值＜最后一轮Ct均值，则受检样品中rcAAV含量为：rcAAV标准品加入量/稀释的AAV样品加入量(vg)。2.重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量检测方法，包括如下步骤：(1)使用约4至5mL容量的细胞培养瓶，例如T25培养瓶，培养细胞；(2)将以下各组接种物加入至各2瓶所述细胞培养瓶中，进行细胞的第一轮感染：i)阳性对照组(PC)：为辅助病毒和rcAAV标准品，其中，辅助病毒用于rcAAV标准品的复制，且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV，例如，1E+4vg，2E+4vg，4E+4vg，6E+4vg，8E+4vg，1E+5vg，2E+5vg rcAAV；ii)加标组(Spike)：为辅助病毒和rcAAV标准品，以及受检样品，其中，辅助病毒用于
rcAAV标准品的复制，且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV，例如，1E+...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀，牛苗，王玉松，潘显辉，
申请(专利权)人：北京锦篮基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：