AAV介导的人脂蛋白脂酶肝脏异位表达载体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及优化的人脂蛋白脂酶基因表达框以及包含所述优化的人脂蛋白脂酶基因表达框的病毒载体，例如，重组腺相关病毒载体。本发明专利技术还涉及所述病毒载体作为基因药物，通过静脉注射，在肝脏特异性表达人脂蛋白脂酶(例如，LPL

【技术实现步骤摘要】
AAV介导的人脂蛋白脂酶肝脏异位表达载体及其用途


[0001]本专利技术涉及生物
具体地，本专利技术涉及一种携带优化的人脂蛋白脂酶基因表达框的重组腺相关病毒载体。通过静脉注射本专利技术的重组腺相关病毒载体，能够获得脂蛋白脂酶的肝脏特异性表达，由此预防和/或治疗严重高甘油三酯血症或由其引起的疾病如急性胰腺炎。

技术介绍

[0002]脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是水解血浆甘油三酯(triglyceride，TG)的关键酶,该酶功能障碍可使血浆乳糜微粒、极低密度脂蛋白等富含甘油三酯的脂蛋白(triglyceride
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rich lipoprotei，TRL)增高，临床表现为乳糜微粒/及低密度脂蛋白血症,血浆甘油三酯升高。
[0003]与LPL密切相关的是糖基磷脂酰肌醇锚定的高密度脂蛋白结合蛋白1(glycosylphosphatidylinositol anchored high density lipoprotein binding protein 1，GPIHBP1)。GPIHBP1位于肌肉和脂肪组织的血管内皮细胞上，能够从血管内皮的基底间隙与来自肌肉细胞和脂肪细胞的LPL结合，并将其转运至毛细血管腔面，在血管腔内为LPL提供附着位点，使得LPL能够水解血浆中TRL上的甘油三酯。GPIHBP1与LPL的结合还能够使LPL保持结构稳定和较高的催化活性。GPIHBP1缺陷会使得LPL无法转运至毛细血管腔发挥水解TRL上TG的作用，造成严重的高甘油三酯血症(Stephen G Young等人，Cell Metab.2019；30(1):51
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65)。
[0004]现有技术中报导了通过肌肉注射重组AAV1病毒载体(所述AAV1是肌肉靶向性高的腺相关病毒载体)介导的人LPL
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S447X表达能够有效治疗LPL基因缺陷小鼠，具有良好的安全性，可长期(约1年)降低血浆甘油三酯，呈剂量依赖性(Ross CJ等人，Hum Gene Ther.2012；15(9):906
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919)。Carpentier等人发现肌肉注射AAV1
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LPL
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S447X可降低LPL基因缺陷患者餐后乳糜微粒水平(Carpentier AC等人，J Clin Endocrinol Metab.97(5):1635
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1644)。Stroes等人向LPL基因缺陷患者腿部肌肉注射两种剂量的携带人LPL
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S447X基因的腺相关病毒载体(1
×
10
11
vg/kg和3
×
10
11
vg/kg)，12周后检测甘油三酯水平,结果表明，与治疗前相比较，甘油三酯水平分别降低27％、41％，26
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36周后,在患者肌肉匀浆中检测到有活性的LPL蛋白，无任何不良反应出现(Stroes ES等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol.2018.28(12):2303
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2304)。Gaudet等对14例LPL基因缺陷型HTG
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AP患者通过肌肉注射施用AAV1
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LPL
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S447X进行基因治疗，患者血浆甘油三酯在12周下降到40％，经过2年临床观察无高甘油三酯血症性胰腺炎(hypertriglyceridemic acute pancreatitis,HTG
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AP)复发和严重不良反应(Glancy D等人，Gene Ther.2013.20(4):361
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369)。鉴于前期临床研究结果证实了该基因治疗方法的安全性和有效性，2012年，欧洲药品局(EMA)批准了西方国家第一个基因治疗药物Alipogene Tiparvovec(商品名：Glybera)，该药的适应症为：严格限制脂肪饮食后仍然发生严重或反复HTG
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AP的LPL基因缺陷患者。
[0005]Glybera是通过肌肉局部注射AAV1
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LPL
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S447X病毒载体来表达LPL。虽然AAV1病毒
载体在注射部位浓度很高，但不能有效扩散至肌肉中血管内皮细胞的血管腔面，需要在患者大腿股四头肌注射二百多个点，不仅需要的AAV1病毒载体的量非常大，而且造成了患者不便依从；此外，肌肉转导AAV1
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LPL
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S447X对降低体内甘油三酯作用有限：LPL只是在肌肉注射局部表达，因此尽管在肌肉的注射位置处LPL活性足够高，但LPL表达仅限于肌肉的局部注射部位，在分解血浆甘油三酯的血管内皮细胞表面的功能部位很少，其降低血浆甘油三酯的疗效有限，长期观察发现难以将血浆甘油三酯降至11.3mmol/L以下。因此Glybera在上市4年后并没有真正用于治疗临床病人，而是在4年后由生产厂家宣布退出了市场。
[0006]所以本领域仍需要预防和/或治疗高甘油三酯血症的备选基因疗法，并且通过多方优化，将这种备选基因疗法达到单次或多次注射后，能够长期表达功能性LPL、且表达的功能性LPL可有效扩散至患者的能够有效分解血浆甘油三酯的组织或器官。
[0007]专利技术概述
[0008]本专利技术提供了一种携带LPL基因表达框的AAV病毒载体。所述AAV病毒载体仅保留了野生型AAV病毒基因组中包装病毒所需要的两个ITR序列或其变体，不含有野生型AAV病毒基因组中的蛋白编码基因，这使得所述AAV病毒载体在施用于患者后的免疫原性低；此外，AAV病毒载体通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带外源基因读框的持续稳定表达，避免了导入生物体的外源基因随机整合而带来的安全性问题。
[0009]本专利技术的AAV病毒载体在单次静脉注射后，对肝脏具有较高的转导效率，保证了LPL基因表达框能够在肝脏内高效地表达LPL蛋白，由此，提供了一种新的预防和/或治疗严重高TG血症的基因药物。
[0010]在第一方面，本专利技术提供了一种优化的人脂蛋白脂酶基因表达框，其包含：
[0011](1)如SEQ ID NO:5所示的启动子序列或者与其具有至少约90％同一性的启动子序列；
[0012](2)插入有SEQ ID NO:2所示的内含子序列或者插入有与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的内含子序列的编码功能性脂蛋白脂酶(例如，LPL
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S447X)的核苷酸序列，例如，
[0013](i)如SEQ ID NO:3所示的优化的编码LPL
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S447X的核苷酸序列；
[0014](ii)与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
[0015](iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的LPL
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S447X，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种优化的人脂蛋白脂酶基因表达框，其包含：(1)如SEQ ID NO:5所示的启动子序列或者与其具有至少约90％同一性的启动子序列；(2)插入有SEQ ID NO:2所示的内含子序列或者插入有与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的内含子序列的编码功能性脂蛋白脂酶(例如，LPL
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S447X)的核苷酸序列，例如，(i)如SEQ ID NO:3所示的优化的编码LPL
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S447X的核苷酸序列；(ii)与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的LPL
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S447X，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(iv)与(i)或(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少70％同一性的序列；和(3)至少一个(例如，2－8个)SEQ ID NO:6所示的人miR
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142
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3p靶序列，例如，具有4个串联的人miR
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142
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3p靶序列，例如，SEQ ID NO:7所示的人miR
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142
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3p靶序列。2.根据权利要求1所述的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框，其还包含：(4)如SEQ ID NO:10所示的或者与其具有至少约90％同一性的BGH polyA序列；和/或(5)如SEQ ID NO:11所示的或者与其具有至少约90％同一性的TBG增强子序列。3.根据权利要求2所述的基因表达框，其碱基全序列如SEQ ID NO:12所示或与SEQ ID NO:12具有至少约90％同一性，特征在于，表达框表达产物为LPL
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S447X。4.一种病毒载体，其特征在于，包含权利要求1－3中任一项所述的优化的人脂蛋白脂酶基因表达框。...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小兵，刘国庆，李维勤，马思思，郭梦梦，董小岩，
申请(专利权)人：北京锦篮基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：