功能性β-半乳糖苷酶变体、AAV介导的人β-半乳糖苷酶表达载体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及功能性β

【技术实现步骤摘要】
功能性
β
‑
半乳糖苷酶变体、AAV介导的人
β
‑
半乳糖苷酶表达载体及其用途


[0001]本专利技术涉及生物
具体地，本专利技术涉及一种携带优化的人β
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半乳糖苷酶基因表达 框的重组腺相关病毒载体。通过施用本专利技术的重组腺相关病毒载体，能够获得β
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半乳糖苷酶特 异性表达，由此预防和/或治疗GM1神经节苷脂贮积症。

技术介绍

[0002]GM1神经节苷脂贮积症又称GM1神经节苷脂病，是由半乳糖苷酶β
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1(GLB1)基因变异影 响GLB活性所致的常染色体隐性遗传病，GLB1基因突变导致溶酶体β
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半乳糖苷酶(β
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gal) 活性降低或消失。而β
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gal的缺乏导致GM1神经节苷脂及其唾液酸化衍生物GA1在中枢神经 系统(CNS)的积累。此外还有低聚糖和硫酸角质素在内脏器官积累。GM1
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神经节苷脂病的发 病率估计为1:100 000
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200 000活产，但在某些种族群体和国家发病率更高。根据发病年龄， 和相应的突变酶变体的残留活性，GM1患者被分为三类，并分别具有极具侵略性或进展相对缓 慢的病程。在婴儿期病人中，由于几乎没有残余的酶活性，神经系统迅速衰退，丧失自主运动 控制能力，导致全身瘫痪，极度消瘦和死亡。其他器官和组织也受到影响，如特征性的肝脾肿 大和骨骼发育不良。晚期儿童和成人发病者的病情则相对较轻，趋于慢性化。
[0003]目前，对GM1神经节苷脂病没有成熟的治疗方法。
[0004]一些基因治疗方法已经在GM1神经节苷脂病的动物模型中进行了测试，包括体内输注腺 病毒、腺相关病毒构建体，以及用逆转录病毒载体对自体骨髓干细胞进行体外改造，等。这些 策略的可行性是基于体内或体外转基因的内源性细胞能够过表达和释放大量的功能性溶酶体 酶到细胞外环境中，而这种分泌使其通过细胞外液体，例如血流，进行扩散分布。而包括中枢 神经系统在内的大多数细胞能够吸收这些酶。
[0005]本领域仍需要预防和/或治疗GM1神经节苷脂沉积病的基因疗法，并且通过多方优化，使 这种备选基因疗法达到单次或多次施用后，能够表达足量功能性GLB1，并且使其有效扩散至 代谢GM1神经节苷脂的组织或器官，发挥其活性。同时，作为对野生型β
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半乳糖苷酶的替代 或改进，带有氨基酸序列点突变的活性酶变体在治疗中的应用也有待于探索。
[0006]专利技术概述
[0007]本专利技术首先提供了一种GLB1基因表达框，其适合于构建到基因治疗载体中，并且至少包 含启动子序列和GLB1基因序列，其中启动子能够驱动或指导GLB1基因对人β
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半乳糖苷酶进 行编码，从而在人体细胞内表达有活性的人β
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半乳糖苷酶。
[0008]本专利技术还提供了一种携带GLB1基因表达框的AAV病毒载体。所述AAV病毒载体仅保留 了野生型AAV病毒基因组中包装病毒所需要的两个ITR序列或其变体，不含有野生型AAV 病毒基因组中的蛋白编码基因，这使得所述AAV病毒载体在施用于患者后的免疫原性低；此 外，AAV病毒载体通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带外源基因阅读框的持续稳 定表达，避免了导入生物体的外源基因随机整合而带来的安全性问题。
[0009]本专利技术的AAV病毒载体在给药后，能够有效地扩散分布至全身，尤其是中枢神经系统、心 脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、血清等组织、器官和部位，保证了GLB1基因表达框能 够在全身，尤其是中枢神经系统、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、血清等组织、器官 和部位内高效地表达出有活性的β
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半乳糖苷酶，从而代偿/弥补此前缺失的酶活性，由此，提供 了一种新的预防和/或治疗GM1神经节苷脂贮积症的基因药物。
[0010]本专利技术还提供了功能性β
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半乳糖苷酶，例如人β
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半乳糖苷酶变体酶。
[0011]在本专利技术的一些实施方案中，表达框中所包含的GLB1基因序列所编码的人β
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半乳糖苷 酶具有与天然存在的人野生型β
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半乳糖苷酶相同或基本相同的氨基酸序列，即与后者具有至少 70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高、或100％的序列同一性，并且具有 不显著低于后者的体内活性，从而能够有效降解GM1神经节苷脂底物以避免和消除其贮积， 并缓解或完全消除疾病症状。其中所述天然存在的人野生型β
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半乳糖苷酶的氨基酸序列例如是 SEQ ID NO:10所示的序列。
[0012]在本专利技术的一些优选实施方案中，表达框中所包含的GLB1基因序列所编码的人β
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半乳 糖苷酶与天然存在的人野生型β
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半乳糖苷酶相比，具有至少70％、80％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或更高、或100％的序列同一性，并且至少具有氨基酸序列点突变I353L、 G245D、R299(L/A/F/Q)中的一个或多个，并且具有不显著低于后者的体内活性，从而能够有效 降解GM1神经节苷脂底物以避免和消除其贮积，并缓解或完全消除疾病症状。其中所述天然 存在的人野生型β
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半乳糖苷酶的氨基酸序列例如是SEQ ID NO:10所示的序列。
[0013]在一个优选的实施方案中，表达框中所包含的GLB1基因序列所编码的人β
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半乳糖苷酶 的氨基酸序列是在SEQ ID NO:10所示的序列的基础上还具有点突变I353L、G245D、 R299(L/A/F/Q)中的一种。
[0014]在一个优选的实施方案中，表达框中所包含的GLB1基因序列所编码的人β
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半乳糖苷酶 的氨基酸序列是SEQ ID NO:11
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16任一项所示的序列。
[0015]在一个优选的实施方案中，表达框中所包含的GLB1基因序列所编码的人β
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半乳糖苷酶 的氨基酸序列是SEQ ID NO:10所示的序列。
[0016]在本专利技术的一些实施方案中，表达框中所包含的编码β
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半乳糖苷酶的核苷酸序列(即 GLB1基因序列)与天然存在的野生型GLB1基因相同或基本相同，即与后者具有至少70％、 80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高、或100％的同一性。其中所述天然存在的 野生型GLB1基因的序列例如是SEQ ID NO:9所示的序列。
[0017]在本专利技术的一些实施方案中，表达框中所包含的GLB1基因序列是经过密码子优化的，在 表达相同氨基酸序列的同时比天然存在的野生型GLB1基因含有更多人体内最常见或更常见的 密码子形式，从而提高表达速度和表达量。在一些优选的实施例中，所述经过密码子优化的序 列是SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种功能性β
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半乳糖苷酶变体酶，所述β
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半乳糖苷酶变体酶相对于天然存在的人野生型β
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半乳糖苷酶(β
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gal)包含氨基酸序列第299位或第245位或第353位的突变，优选地包含第299位的突变。2.如权利要求1所述的功能性β
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半乳糖苷酶变体酶，其相对于天然存在的人野生型β
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半乳糖苷酶包含以下(i)
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(iii)的氨基酸序列突变中的任一项：(i)在氨基酸序列第299位，由精氨酸突变为亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或谷氨酰胺；(ii)在氨基酸序列第245位，由甘氨酸突变为天冬氨酸；(iii)在氨基酸序列第353位，由异亮氨酸突变为亮氨酸。3.核酸分子，其编码如权利要求1或2所述的功能性β
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半乳糖苷酶变体酶。4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于具有如SEQ ID NO:17、19、21、23、25或27所示的核苷酸序列，或因遗传密码的简并性而与之不同的核苷酸序列。5.一种优化的人GLB1基因表达框，其包含：(1)如SEQ ID NO:1所示的启动子序列或者与其具有至少约90％同一性的启动子序列；和(2)编码功能性β
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半乳糖苷酶的GLB1基因序列，所述功能性β
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半乳糖苷酶为天然存在的人野生型β
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半乳糖苷酶或如权利要求1所述的β
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半乳糖苷酶变体酶。6.如权利要求5所述的人GLB1基因表达框，其中(2)所述的编码功能性β
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半乳糖苷酶的GLB1基因序列选自以下(i)
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(vi)中任一项：(i)编码如SEQ ID NO:10
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16任一项所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(ii)如SEQ ID NO:2或9所示的核苷酸序列；(iii)与权利要求3或4的核酸分子相同的核苷酸序列；(iv)与如(i)
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(iii)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；(v)与(i)
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(iii)的核苷酸序列编码相同的β
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半乳糖苷酶，但因遗传密码的简并性而与(i)
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(iii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；(vi)与(i)至(v)任一项所述的核苷酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。7.根据权利要求5
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6任一项所述的基因表达框，其中在相邻的元件(1)和(2)之间具有间隔序列，所述间隔序列的长度不超过20个核苷酸。8.根据权利要求5
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6任一项所述的优化的人GLB1基因表达框，其进一步包含(3)如SEQ ID NO:4所示的或者与其具有至少约90％同一性的BGH polyA序列。9.根据权利要求8所述的基因表达框，其中在相邻的元件(1)和(2)之间和/或(2)和(3)之间具有间隔序列，所述间隔序列的长度不超过20个核苷酸。10.根据权利要求5
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6任一项或权利要求8所述的优化的人GLB1基因表达框，其进一步包含(4)至少一个(例如，1－5个)串联的SEQ ID NO:3所示的人miR
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142
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3p靶序列，例如，具有1个，或2或3个串联的人142
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3...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小兵，马文豪，章嫣，武志杰，
申请(专利权)人：北京锦篮基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：