用于治疗Ⅱ型粘多糖贮积症的重组腺相关病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种携带IDS基因表达框的重组腺相关病毒载体及其在治疗Ⅱ型粘多糖贮积症的应用。的应用。

【技术实现步骤摘要】
用于治疗Ⅱ型粘多糖贮积症的重组腺相关病毒载体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种携带IDS基因表达框的重组腺相关病毒载体及其在治疗Ⅱ型粘多糖贮积症的应用。

技术介绍

[0002]粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)是一类因溶酶体内相关的酸性水解酶缺乏或活性降低使酸性黏多糖(也称糖胺聚糖，glycosaminoglycan，GAG)无法降解或降解不完全，导致GAG及其中间代谢产物在体内堆积引起的严重致残、致死的单基因遗传性代谢病。
[0003]根据溶酶体分解酶缺陷及贮积粘多糖种类的不同，目前可将MPS分为7大型，包括：MPSⅠ型(含ⅠH、ⅠS、ⅠH/S三种亚型)，MPSⅡ型(含ⅡA、ⅡB两种亚型)，MPSⅢ型(含ⅢA、ⅢB、ⅢC、ⅢD四种亚型)，MPSⅣ型(含ⅣA、ⅣB两种亚型)，MPS
Ⅵ
型(含
Ⅵ
A、
Ⅵ
B两种亚型)，MPS
Ⅶ
型，MPS
Ⅸ
型。中国以MPSⅠ、Ⅱ、Ⅳ、
Ⅵ
四型较常见。
[0004]Ⅱ型粘多糖贮积症(Mucopolysaccharidosis typeⅡ，MPSⅡ)也称为Hunter综合征，是粘多糖贮积症中唯一的X染色体连锁隐性遗传疾病，是一种罕见的遗传病，发病率约为0.38/10万～1.09/10万，欧洲国家的发病率通常低于东亚国家，在东亚国家中，MPSⅡ发病率约占所有粘多糖贮积症(MPS)的50％。患者的溶酶体缺乏艾杜糖醛酸2
‑
硫酸酯酶(iduronate 2
‑
sulphatase，I2S)，导致硫酸皮肤素(DS)和硫酸乙酰肝素(HS)这两种糖胺聚糖(GAGs)的病理积累和大多数器官系统(包括大脑)的功能障碍。
[0005]MPSⅡ患者会在大多数器官系统中受到不同程度的影响，疾病表现出显著的异质性。根据MPSⅡ的临床表现分为轻型和重型两种，其中重型约占2/3。共同的临床体征和症状包括尿GAGs(uGAGs)水平发生变化，面部粗糙，骨骼畸形和关节僵硬，生长迟缓导致的身材矮小，呼吸系统和心脏损伤，包括弥漫性瓣膜病，腹股沟和脐疝以及肝脾肿大等。患者也有耳鼻喉表现包括听力丧失、腺扁桃体肥大、频繁的耳和上呼吸道感染、睡眠障碍、阻塞性呼吸暂停和视网膜恶化等。重型患者存在神经系统疾病，主要表现为认知障碍和严重的行为问题。患者通常在出生时表现正常，体征通常在2至4岁开始出现，重型患者的体征通常较早出现，轻型患者体征/症状进展缓慢，没有或较少存在认知问题，并且没有行为障碍。在主要的临床改变中，心肺衰竭通常是死亡的原因，严重形式发生在成年之前，而轻度形式的可以存活到成年后期。
[0006]在病因学上，MPSⅡ是由于IDS基因突变引起，所述突变导致溶酶体内I2S酶活性降低或消失，继而导致HS、DS在溶酶体内累积，从而致使细胞和器官损伤，使患者发生进行性细胞和多器官功能障碍。IDS基因，位于Xq28，CDS全长1653bp，该基因编码一个550个氨基酸的多肽，该多肽被加工后形成艾杜糖醛酸2
‑
硫酸酯酶(iduronate 2
‑
sulphatase，I2S)蛋白。成熟形式是单体，大小为76kDa，由两个亚结构域组成(42kDa的重链和14kDa的轻链)。在溶酶体内催化硫酸皮肤素(DS)和硫酸乙酰肝素(HS)中2
‑
O
‑
磺基
‑
α
‑
L
‑
艾杜糖醛酸残基的C2
‑
硫酸酯键的水解。IDS为管家基因，在全身各脏器广泛表达，其中中枢神经系统中总体表
达量较高。
[0007]MPSⅡ的治疗一直是姑息性的，专注于体征和症状的治疗。自从分别于1970年代和1990年代发现该疾病的生化和遗传基础以来，已经进行了许多研究，采用了不同的策略，目的是开发针对该疾病的特定疗法。这些努力导致1980年代的造血干细胞移植(HSCT)和2006年的酶替代疗法(ERT)进入临床实践。尽管这些治疗策略(主要是ERT)如今已用作MPS的治疗可选方案，关于其应用的有效性和安全性，还有许多问题尚待解决。
[0008]MPSⅡ的ERT治疗目前可以使用两种不同的重组酶：Elaprase，于2006年获得美国食品药品监督管理局的批准；以及艾杜糖硫酸酯酶beta，于2012年获得韩国食品药品监督管理局的批准。两种酶显示出类似的生物化学和物理化学性质，临床前研究显示两者在降低器官GAG水平方面具有相似的分布和功效，但艾杜糖硫酸酯酶beta表现出更高特异性的酶活性，可以更快通过细胞摄取以及降低抗药物抗体的形成。ERT在某些组织中的功效有限，可以解释为治疗酶的生物利用度低，这是由于组织(如骨，软骨和心脏瓣膜)的血管化程度低，以及用于中枢神经系统治疗存在生物屏障(例如血脑屏障)。免疫反应会降低治疗效果。超过50％的患者产生抗IDS的IgG抗体，其中21％至35％的患者产生了中和性IgG抗体。ERT治疗费用昂贵。如ELAPRASE需每周给药一次，每年治疗费用高达30多万美元。
[0009]HSCT能够改善疾病的躯体和骨骼症状，对身高和体重的影响与ERT相同。一项研究评估了HSCT的长期效果，显示尿液GAG水平，心脏瓣膜反流，脑磁共振成像(MRI)萎缩，I类和Ⅱ类脑损伤以及日常生活活动(ADL)有所改善。但这些改善仅在脑萎缩和心脏瓣膜反流发生之前接受治疗的患者中观察到。通过一次性给药，HSCT将显著帮助降低ERT每周给药的治疗费用。HSCT费用为70,000至205,000美元，但寻找捐助者的时间和成本高昂，此外受供体细胞类型影响的手术成功率以及并发症包括感染，器官衰竭，移植排斥，GVHD等影响，HSCT有相对较高的死亡率。
[0010]AAV由于其稳定性、长期表达和低免疫原性，已经成为MPS基因治疗中最常用的病毒工具。Monica Cardone(Correction of Hunter syndrome in the MPSII mouse model by AAV2/8
‑
mediated gene delivery.Human Molecular Genetics,2006,Vol.15,No.7 1225
–
1236)首次在在MPS II中使用基于AAV载体的基因治疗，使用AAV2/8载体，将其静脉注射给成年MPS II小鼠。治疗后小鼠的酶活性得到完全恢复，血浆、脾脏、肺、心脏、肾脏、大脑和肌肉中的GAG存储被完全清除，骨骼畸形也得以正常化。然而，小鼠在野外测试中表现不佳，行走方式受到严重损害；此外，还表现出神经病理学缺陷。Sandra Motas等(CNS
‑
directed gene therapy for the treatment of neurologic and somatic mucopolysaccharidosis本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶基因表达构建体，其包含：(1)如SEQ ID NO:1所示的启动子序列，或者与其具有至少约90％同一性的启动子序列，其中所述序列在相应于SEQ ID NO:1的核苷酸568位具有核苷酸C；(2)编码艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶的核酸，优选地，所述核酸编码具有选自以下的氨基酸序列的艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶：(a)SEQ ID NO:10的氨基酸1至氨基酸550；(b)SEQ ID NO:10的氨基酸26至氨基酸550；(c)SEQ ID NO:10的氨基酸34至氨基酸550；(d)与前述任一具有至少约90％同一性的氨基酸序列；更优选地，所述核酸包含选自以下的核苷酸序列：(i)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(ii)与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列编码相同的艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶，但因遗传密码的简并性而与(i)或(ii)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(iv)与(i)或(ii)或(iii)所述核苷酸序列具有至少80％同一性的序列；和(3)至少一个(例如，2－8个)SEQ ID NO:7所示的人miR
‑
142
‑
3p靶序列，例如，具有2个串联的人miR
‑
142
‑
3p靶序列，例如，SEQ ID NO:3所示的人miR
‑
142
‑
3p靶序列。2.根据权利要求1所述的艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶基因表达构建体，其还包含选自以下之一或多项：(1)Kozak序列，(2)转录终止子，例如polyA信号序列，优选地选自SV40晚期polyA序列、兔β
‑
珠蛋白polyA序列、牛生长激素polyA序列，更优选牛生长激素polyA序列。3.一种重组AAV病毒载体，其特征在于，包含权利要求1－2中任一项所述的艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶基因表达构建体。4.一种重组AAV病毒载体，其中所述重组AAV载体在其基因组中包含：a.5
’
和3
’
AAV反向末端重复(ITR)序列，和b.位于5
’
和3
’
ITR之间的权利要求1或2的表达构建体，优选地，其中所述表达构建体包含以转录方向彼此功能性连接的如下元件：
‑
如SEQ ID NO:1所示的启动子序列，
‑
Kozak序列，
‑
编码人艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶(IDS)的多核苷酸，
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小兵，马文豪，武志杰，
申请(专利权)人：北京锦篮基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：