一种融合蛋白基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种融合蛋白基因及其应用，由分泌信号肽基因、猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白基因、猪A群轮状病毒抗原性蛋白基因和猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白基因连接而成的融合蛋白基因CTLA4

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白基因及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种融合蛋白基因及其应用。

技术介绍

[0002](1)猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠状病毒科猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的各年龄段的猪腹泻、呕吐、脱水以及特别对一周龄内的哺乳仔猪高度致死为特征的一种高度接触性肠道传染病。流行性腹泻病毒S基因核苷酸长短不一，其核苷酸长度在4143bp
‑
4161bp之间。多年来，关于PEDV的S基因的分子流行病学数据研究较多，通过研究发现，S基因可用来作为PEDV基因分型的一个依据，可将其分为2个大的基因群，G1基因群和G2基因群，各个亚群均可细分为2个小的遗传分支，即G1
‑
1、G1
‑
2和G2
‑
1、G2
‑
2。研究还发现，G1基因群均存在有碱基缺失或插入现象(以基因插入为主)。G1基因群PEDV毒株既存在大量的氨基酸点突变外，又存在氨基酸插入和缺失现象；但G2基因群PEDV毒株却不存在氨基酸插入现象，以氨基酸点突变为主。G1基因群PEDV毒株氨基酸序列与CV777(G2基因群代表株)的同源性为93.0％
‑
93.8％。由于PEDV只有一个血清型，氨基酸的变异并不会对血清型产生影响，但推测其和疫苗的推荐使用密切相关。对PEDV新流行株的S基因序列分析发现，PEDV流行株S基因已出现缺失(197aa)和插入(4aa)，表明随着疫苗的使用，PEDV基因组进化趋势增强。以S基因绘制PEDV遗传进化树发现PEDV可分为2个明显的分支G1和G2，G1分支主要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV早期分离株，而G2分支均为新PEDV流行株。目前流行性腹泻疫苗主要有活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗等类型；从目前流行性腹泻疫苗所表现出来的免疫效果来看，其中亚单位疫苗和灭活疫苗免疫效果一般，经典的活疫苗已经保护不了变异病毒造成的危害。
[0003](2)猪急性腹泻综合征(swine acute diarrhea syndrome，SADS)是由猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS
‑
CoV)引起的一类急性传染病。临床表现主要有感染仔猪急性腹泻、呕吐，5日龄内新生仔猪由于体重骤减和严重脱水而迅速死亡，且死亡率高达90％。通过检测发现猪急性腹泻综合征并不是已知的猪腹泻冠状病毒所引起的，通过将病毒分离培养鉴定后发现这是一种新型的猪肠道冠状病毒，与蝙蝠来源的HKU2核苷酸序列同源性达到90％以上；且至今仍无有效的SADS疫苗和抗病毒药物问世，目前防控该病主要措施就是控制传染源和切断潜在的传播途径。
[0004](3)轮状病毒(Rotavirus，简称RV)属呼肠弧病毒科(Reoviridae)，轮状病毒属，仔猪、耗牛、绵羊、山羊、幼驹、鸡、火鸡及其他禽类均可感染轮状病毒。轮状病毒体的核心为双股RNA，由11个不连续的RNA节段组成；与RV抗原有关的主要结构蛋白有VP4、VP6、VP7，根据内壳结构蛋白VP6抗原性的不同，目前将RV分为A
‑
G七个群，其中最常见的是A群(A群也是主要引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原体)。轮状病毒在世界范围内广泛流行，导致仔猪生长缓慢或死亡率升高，给养猪业造成了巨大的经济损失。而目前对于猪轮状病毒病没有有效的药物，常规治疗方法不佳，疫苗是预防和控制该病的主要措施。然而，猪轮状病毒的分离比较困难，且分离的病毒株病毒滴度较低，不利于后期的培养增殖，造成制
备的疫苗组合物免疫效力不高，无法有效对猪轮状病毒病进行有效防控。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种融合蛋白基因，所述融合蛋白基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；用于编码该融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]可选的，所述融合蛋白基因由分泌信号肽基因、猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白、猪A群轮状病毒抗原性蛋白和猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白连接而成，所述的融合蛋白基因的表达为CTLA4
‑
PEDVS
‑
PoRVP6
‑
SADSVS。
[0007]可选的，所述分泌信号肽的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]可选的，所述猪的CTLA4的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]可选的，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白为猪流行性腹泻病毒S蛋白片段，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列为SEQ ID NO.5，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白片段是所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列的第455
‑
890位氨基酸序列。
[0010]可选的，所述猪A群轮状病毒抗原性蛋白为猪A群轮状病毒VP6蛋白片段，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列为SEQ ID NO.6，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白片段是所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列的第8
‑
404位氨基酸序列。
[0011]可选的，所述猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白为猪急性腹泻综合症病毒S蛋白片段，所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白的基因序列为SEQ ID NO.7，所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白片段是所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白的基因序列的第17
‑
538位氨基酸序列。
[0012]一种重组载体，所述重组载体含上述所述的融合蛋白基因，所述重组载体为包含猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒基因、猪A群轮状病毒基因以及猪急性腹泻综合症病毒基因的重组5型腺病毒载体。
[0013]可选的，所述重组载体为含有上述所述核苷酸序列的腺病毒表达载体pDC316或者pAdv
‑
CAG，该重组载体的表达为rAd
‑
CTLA4
‑
PEDVS
‑
PoRVP6
‑
SADSVS。
[0014]一种重组载体的制备方法，包括以下步骤：
[0015]1)、将含上述所述核苷酸序列的重组载体克隆到pDC316载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，获得重组穿梭质粒；
[0016]2)、重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体pBHGlox_1,3cre进行体外重组，得到重组腺病毒；
[0017]3)、包装重组腺病毒后，转染Hek293细胞；
[0018]4)、等细胞病变收集细胞，细胞裂解后的上清纯化产物即得。
[0019]所述的融合蛋白基因在制备用于预防和治疗猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒和猪急性腹泻综合症病毒的疫苗或者药物中的应用。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0021]本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白基因，其特征在于，所述融合蛋白基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的融合蛋白基因，其特征在于，用于编码该融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白基因，其特征在于，所述融合蛋白基因由分泌信号肽基因、猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白、猪A群轮状病毒抗原性蛋白和猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白连接而成，所述的融合蛋白基因的表达为CTLA4
‑
PEDVS
‑
PoRVP6
‑
SADSVS；所述分泌信号肽的基因序列如SEQ ID NO.3所示；所述猪的CTLA4的基因序列如SEQ ID NO.4所示；所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白为猪流行性腹泻病毒S蛋白片段，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列为SEQ ID NO.5，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白片段是所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列的第455
‑
890位氨基酸序列；所述猪A群轮状病毒抗原性蛋白为猪A群轮状病毒VP6蛋白片段，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列为SEQ ID NO.6，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白片段是所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列的第8
‑
404位氨基酸序列；所述猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白为猪急性腹泻综合症病毒S蛋白片段，所述猪急性腹...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大生，
申请(专利权)人：长沙爱科博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：