具有降低的免疫原性的TRAIL组合物制造技术

已经开发了具有修饰的多聚化结构域的融合多肽，该多聚化结构域为融合多肽提供高表达、溶解性、稳定性和低免疫原性。相对于具有未修饰的多聚化结构域的TRAIL组合物，这些融合多肽在哺乳动物宿主中显示出改善的物理化学和生物学特性以及较低的免疫原性。TRAIL组合物在体内诱导癌细胞和癌症相关的成纤维细胞的凋亡，从而减小肿瘤尺寸。从而减小肿瘤尺寸。从而减小肿瘤尺寸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有降低的免疫原性的TRAIL组合物
[0001]关于联邦资助研究的声明
[0002]本专利技术是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的第4U44AA026111
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03号拨款下，在政府支持下完成的。政府对本专利技术享有某些权利。
[0003]关于序列表
[0004]根据37C.F.R.
§
1.52(e)(5)，于2021年6月4日提交的序列表，作为名为“THER_116_PCT_ST25.txt”的文本文件，创建于2021年6月4日，大小为60,827字节，特此通过引用并入。


[0005]本专利技术笼统而言涉及含有肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的融合多肽，该配体含有修饰的异亮氨酸拉链(miLZ)结构域。

技术介绍

[0006]肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)是TNF
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α超家族中的II型跨膜蛋白，与TNF和FasL具有序列同源性。TRAIL可以通过蛋白水解从细胞表面切下并以可溶形式释放。可溶性TRAIL本质上是同源三聚体，随后在结合后三聚化TRAIL受体。已在人类中鉴定出五种TRAIL受体，但只有TRAIL
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R1/DR4和TRAIL
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R2/DR5受体启动类似于Fas/FasL和TNF
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R/TNF信号途径的细胞凋亡。TRAIL受体结合刺激与募集的衔接蛋白、具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)形成死亡诱导信号复合物(DISC)。FADD募集酶原(procaspase)8和酶原10，并且DISC允许自动激活这些半胱天冬酶(caspase)。该信号的下游是半胱天冬酶3/6/7的蛋白水解切割和激活，导致细胞凋亡。另一种细胞凋亡途径是诱导线粒体功能障碍和膜透化，导致激活半胱天冬酶9的细胞色素c释放，最后裂解半胱天冬酶3/7，导致细胞凋亡。TRAIL还可以与其诱饵受体TRAIL
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R3/DcR1和TRAIL
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R4/DcR2结合，但这些受体缺乏功能性死亡结构域，无法诱导细胞凋亡。
[0007]TRAIL与TNF超家族的其他成员(例如TNF和CD95L)之间的一个主要区别是TRAIL不能诱导正常组织的细胞死亡。已经尝试使用TNF和CD95L诱导细胞死亡的多种医学或药物应用。由于TNF和CD95L蛋白会诱导正常细胞以及癌细胞和过度激活的免疫细胞的死亡，因此它们的适用性有限。相比之下，TRAIL在广泛的癌细胞和过度激活的免疫细胞中诱导细胞凋亡，而对正常细胞几乎没有影响。这是由于细胞类型之间TRAIL受体的差异表达。
[0008]已鉴定出五种TRAIL受体。其中，DR4(TRAIL
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R1)和DR5(TRAIL
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R2)是代表性的细胞死亡相关受体。当TRAIL与DR4或DR5结合时，受体的细胞内死亡结构域被激活，从而通过各种信号转导途径转导细胞凋亡信号，导致凋亡性细胞死亡。TRAIL还可以结合不诱导细胞凋亡的DcR1、DcR2和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)。细胞死亡诱导受体DR4和DR5在正常细胞和肿瘤细胞之间的表达水平没有明显差异。相比之下，其他三种不诱导细胞凋亡的受体在正常细胞中以高水平表达，但在肿瘤细胞中以低水平表达或根本不表达。因此，在正常细胞中，TRAIL主要结合不包含死亡结构域的DcR1、DcR2和OPG，因此不诱导细胞死亡。相反，在癌细胞和过度激活的免疫细胞中，细胞凋亡是由TRAIL与包含死亡结构域的DR4和DR5的结
合诱导的。TRAIL的这种选择性细胞凋亡诱导在医学或制药应用中是一个特别有吸引力的特征。
[0009]已在包括结肠癌、神经胶质瘤、肺癌、前列腺癌、脑肿瘤和多发性骨髓瘤细胞的多种类型的癌细胞中观察到TRAIL介导的细胞凋亡。TRAIL已被证明在动物体内具有非常高的抗癌活性。通过单独使用TRAIL以及与其他抗癌药物，如紫杉醇和阿霉素(doxorubicin)和放疗组合使用，已经获得了TRAIL的好的抗癌功效。除癌症外，TRAIL还用于治疗关节炎(自身免疫性疾病)，通过诱导过度激活的免疫细胞的死亡来缓解和治疗关节病。除了蛋白治疗外，还尝试通过递送TRAIL基因进行基因治疗。TRAIL还可用于治疗T细胞介导的自身免疫性疾病，例如狼疮、类风湿性关节炎和I型糖尿病。
[0010]然而，天然TRAIL作为治疗剂存在一些问题。主要问题是天然TRAIL的三聚体形成率低。TRAIL单体不与TRAIL受体结合，因此不会诱导细胞凋亡。在这方面，已经进行了许多研究，目的是改善TRAIL的三聚体结构和三聚体形成率。锌离子在天然TRAIL的三聚化中起关键作用。TRAIL的突变体是根据计算机分析结果开发出来的。对于TRAIL三聚体的形成，最有用的方法似乎是引入有利于三聚体折叠的氨基酸序列。此类序列包括亮氨酸拉链(LZ)基序和异亮氨酸拉链(iLZ)基序。Henning Walczak报道了三聚体TRAIL衍生物的抗癌功效，其中亮氨酸拉链基序被添加到天然TRAIL的N末端(Walczak et al.,Nature Medicine,5:157
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163(1999))。Kim报道了一种含有异亮氨酸拉链基序并具有良好细胞凋亡活性的TRAIL衍生物(Kim et al.,BBRC,321:930
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935(2004))。
[0011]TRAIL在不同物种中具有不同的半衰期。例如，据报道，TRAIL在啮齿类动物中的半衰期为几分钟，在类人猿中的半衰期约为30分钟(Xiang,et al.,Drug Metabolism and Disposition,32:1230
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1238(2004))。大多数TRAIL通过肾脏迅速排泄掉。这种短的半衰期被认为是TRAIL药物用途的一个缺点，使得需要具有延长半衰期的TRAIL或其衍生物。其他需要解决的问题包括TRAIL的低溶解度和溶液稳定性。重组TRAIL的半衰期极短，不稳定并且在高浓度下聚集(aggregate)。因此，未修饰的TRAIL在体内药物开发中的用途有限。
[0012]TRAIL在临床应用中的另一个问题涉及对某些组织正常细胞的细胞毒性。大多数正常细胞对由各种TRAIL受体的表达引起的细胞毒性都有耐药性，但一些肝细胞和角质形成细胞对TRAIL介导的细胞毒性敏感(Yagita et al.,Cancer Sci.,95:777
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783(2004)；Jo et al.,Nature Medicine,6:564
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567(2000)；Zheng et al.,J.Clin.Invest.,113:58
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64(2004))。
[0013]仍然需要具有生物活性、高纯度的TRAIL组合物和TRAIL缀合物，它们保留天然TRAIL的生物活性，具有延长的血清半衰期、增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组融合多肽，其包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，所述第一氨基酸序列包含与SEQ ID NO：4
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8中的任一项具有至少90％同一性且在第14、17或26位具有至少一个缬氨酸(V)、谷氨酸(E)和/或谷氨酰胺(Q)的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的重组融合多肽，其中所述第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：9
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26中任一项的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的重组融合蛋白，其中所述第一氨基酸包含SEQ ID NO：4并且所述第二氨基酸包含SEQ ID NO：15。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的重组融合多肽，其中所述多肽进一步包含所述第一氨基酸和所述第二氨基酸之间的接头。5.根据权利要求4所述的重组融合多肽，其中所述接头包含氨基酸接头。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的重组融合多肽，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列通过选自氨基酸Asp(D)、Gly(G)、DG、KGSG(SEQ ID NO：27)、GSG、SG和RGSG(SEQ ID NO：28)中的接头连接。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的重组融合多肽，其中，所述融合多肽具有SEQ ID NO：30。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的重组融合多肽，其中，所述多肽中的两种以上为二聚体、三聚体、四聚体或多聚体形式。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的重组融合多肽，其在生理缓冲液和生理pH下的溶解度在约0.2mg/ml和100mg/ml之间，优选在约0.5mg/ml和50mg/ml之间。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的重组融合多肽，其中所述多肽是抑制性多肽，当在COLO 205细胞上测试时，其体外半数抑制浓度(IC50)在约0.001nM和约0.1nM之间，优选在约0.001nM和约0.05nM之间。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的重组融合多肽，其具有约1小时至24小时之间的体内半衰期。12.根据权利要求1
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10中任一项所述的重组融合多肽，其在哺乳动物宿主，优选人宿主中的免疫原性相对于具有与SEQ ID NO：4
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8中的任一项具有至少90％同一性且在第14、17或26位不具有至少一个缬氨酸(V)、谷氨酸(E)和/或谷氨酰胺(Q)的第一氨基酸的相应多肽的免疫原性显著较低。13.一种缀合物，其包含根据权利要求1
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12中任一项所述的重组融合多肽和半衰期延长分子。14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述半衰期延长分子包括聚乙二醇或其衍生物。15.根据权利要求13或14所述的缀合物，其中所述半衰期延长分子包括分子量在约5000Da和约100000Da之间的聚乙二醇或其衍生物。16.根据权利要求13
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15中任一项所述的缀合物，其在生理浓度的盐存在下具有至多约50mg/ml的溶解度。17.根据权利要求13
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16中任一项所述的缀合物，其在非人灵长类动物中具有约20小时至约50小时的体内半衰期。18.根据权利要求13
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17中任一项所述的缀合物，当在激活的肝星状细胞(HSC)上测试
时，其体外IC50介于约0.01nM和约1nM之间，优选介于约0.01nM和约0.5nM之间。19.根据权利要求13
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18中任一项所述的缀合物，其中所述重组融合多肽的两次或更多次冻融循环基本上不降低所述缀合物的溶解度和活性。20.根据权利要求13
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19中任一项所述的缀合物，其在哺乳动物宿主，优选人宿主中的免疫原性相对于具有与SEQ ID NO：4
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8中的任一项具有至少90％同一性且在第14、17或26位不具有至少一个缬氨酸(V)、谷氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历克斯，
申请(专利权)人：赛力纤维症相关疾病医药公司，
类型：发明
国别省市：