靶向uPAR的CAR-T细胞及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种分离的多核苷酸，包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含识别尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)的结构域、间隔区、跨膜结构域和T细胞活化结构域。本发明专利技术还提供表达所述多肽的T细胞，预防或治疗与uPAR阳性的细胞相关的疾病的方法。细胞相关的疾病的方法。细胞相关的疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
靶向uPAR的CAR
‑
T细胞及其用途


[0001]本专利技术属于免疫治疗领域。具体而言，涉及靶向尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR) 的嵌合抗原受体(CAR)
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T细胞及其清除衰老细胞及肿瘤细胞的用途。

技术介绍

[0002]中国已快速步入老龄化社会，随之而来的老年退行性疾病逐年增多，造成社会医疗负担不断加重。近年研究发现，随着年龄增长，体内各脏器组织中出现渐进性的衰老细胞蓄积，造成各种老年退行性疾病以及肿瘤的发生。衰老细胞是一类无分裂增殖功能、但能够蓄积在各脏器组织内并长期存活的细胞群体，通过其自分泌功能分泌多种细胞因子至脏器组织的微环境，导致器官功能下降及退行性病变。健康机体能够通过自身免疫系统(NK细胞)不断清除蓄积的衰老细胞，而随着年龄的增长，自身免疫系统的自我清除功能逐年下降，导致衰老细胞的大量蓄积及各脏器组织的退行性病变。
[0003]有研究表明，尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)在衰老细胞和肿瘤细胞表面高表达，而在正常组织(支气管上皮、单核细胞、中性粒细胞及巨噬细胞)不表达或表达极低。uPAR可在纤维蛋白溶解过程中促进细胞外基质的降解、促进创伤愈合、促进肿瘤的发生，同时，uPAR能够促进肿瘤细胞的移行、浸润及存活。uPAR可部分裂解为可溶性uPAR(suPAR)入血，同时衰老细胞也可以分泌suPAR入血，因而外周血suPAR 可作为临床检测的一项血清标志物。
[0004]研究发现，一些药物能够清除衰老细胞，如Bcl
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2抑制剂Navitoclax等已应用于清除衰老细胞的临床前研究，但因其严重的毒副反应而受限。
[0005]近年来CAR
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T技术的发展迅猛，采用uPAR作为靶标制备衰老细胞靶向CAR
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T成为一个独特的创新思路。理论上，设计和制备uPAR
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scFv单抗并设计CAR全基因序列，能够制备针对uPAR的CAR
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T细胞。然而，目前还没有报道针对uPAR的成功的CAR
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T 疗法。本领域仍然需要新的针对uPAR的抗衰老和抗肿瘤疗法。

技术实现思路

[0006]在第一方面，本专利技术提供一种分离的多核苷酸，包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含识别尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)的结构域、间隔区、跨膜结构域和T 细胞活化结构域。
[0007]在一些实施方案中，所述识别uPAR的结构域是uPA多肽或其片段。在一些实施方案中，所述uPA多肽的片段是uPA多肽的氨基末端片段。在一些实施方案中，所述uPA 多肽是人uPA。在一些实施方案中，所述uPA多肽的片段包含SEQ ID NO:3。
[0008]在一些实施方案中，所述T细胞活化结构域包含至少一个T细胞活化基序。在一些实施方案中，所述T细胞活化结构域包含至少两个T细胞活化基序。在一些实施方案中，所述T细胞活化结构域包含两个T细胞活化基序。
[0009]在第二方面，本专利技术提供一种真核表达载体，包含本专利技术的多核苷酸。
[0010]在第三方面，本专利技术提供一种制备靶向uPAR阳性细胞的T细胞的方法，包括用本专利技术的载体转化T细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从外周血单个核细胞 (PBMC)分离T细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括体外扩增T细胞。
[0011]在第四方面，本专利技术提供一种靶向uPAR阳性的细胞的T细胞。
[0012]在一些实施方案中，通过本专利技术第三方面的方法获得所述T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞表达本专利技术的多核苷酸所编码的多肽。在一些实施方案中，所述T细胞还表达额外的多肽。在一些实施方案中，所述额外的多肽选自单纯疱疹胸苷激酶、截短的表皮生长因子受体和可诱导的半胱氨酸蛋白酶9。
[0013]在第五方面，本专利技术提供一种药物组合物，包含本专利技术的T细胞。
[0014]在第六方面，本专利技术提供一种预防或治疗与uPAR阳性的细胞相关的疾病的方法，包括给有需要的对象施用本专利技术的T细胞或药物组合物。
[0015]本专利技术还提供本专利技术的多核苷酸、载体、T细胞或药物组合物在制备用于预防或治疗与uPAR阳性的细胞相关的疾病的药物中的用途。
[0016]在一些实施方案中，所述uPAR阳性的细胞是衰老细胞或肿瘤细胞。
附图说明
[0017]图1显示本专利技术的CAR的结构。
[0018]图2显示编码hATF
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CAR(A幅)和mATF
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CAR(B幅)的亲本质粒的结构。
[0019]图3显示生成mcDNA的原理。
[0020]图4显示hATF
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CAR
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mcDNA以XbaI和NheI消化的产物的电泳结果。
[0021]图5显示mATF
‑
CAR
‑
mcDNA以XbaI和NheI消化的产物的电泳结果。
[0022]图6显示经转染的人和小鼠T细胞在荧光显微镜下的成像结果。
[0023]图7显示经转染的人和小鼠T细胞流式细胞术检测的结果，左幅：人T细胞；右幅：小鼠T细胞。
[0024]图8显示通过流式细胞术检测NALM6细胞经转染前和转染后的人uPAR表达的结果。
[0025]图9显示不同效靶比hATF
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CAR
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T细胞对靶细胞的杀伤效率。
[0026]图10显示西妥昔单抗对hATF
‑
CAR
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T细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 (ADCC)。
[0027]图11显示皮下移植的肿瘤的免疫组化染色结果(
×
200)，A幅
‑
C幅：造模11天各组 uPAR表达；D幅：生理盐水治疗后的uPAR表达；E幅：未经转染的T细胞治疗后的 uPAR表达；F幅：hATF
‑
CAR
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T细胞治疗后的uPAR表达。
[0028]图12显示外周血suPAR的ELISA检测结果。
[0029]图13显示CCl4诱导的肝纤维化模型中，肝组织H&E染色(上4幅)和SA
‑
β
‑
Gal染色(下面4幅)的结果(
×
200)。
[0030]图14显示肝纤维化模型中，治疗前(上4幅)和治疗后(下面4幅)肝组织SA
‑
β
‑
Gal 染色的结果(
×
200)。
[0031]图15显示肝纤维化模型中，治疗前和治疗后血清suPAR的ELISA检测的结果。
[0032]图16显示肝纤维化模型中，不同治疗后肝组织H&E染色的结果(
×
100)。
[0033]图17显示肝纤维化模型中，不同治疗后肝组织免疫组化染色结果，上面4幅：针对...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离的多核苷酸，包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含识别尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)的结构域、间隔区、跨膜结构域和T细胞活化结构域。2.权利要求1的多核苷酸，其中所述识别uPAR的结构域是uPA多肽或其片段。3.权利要求2的多核苷酸，其中所述uPA多肽的片段是uPA多肽的氨基末端片段。4.权利要求2的多核苷酸，其中所述uPA多肽是人uPA。5.权利要求2的多核苷酸，其中所述uPA多肽的片段包含SEQ ID NO:3。6.权利要求1
‑
5任一项的多核苷酸，其中所述T细胞活化结构域包含至少一个T细胞活化基序。7.权利要求6的多核苷酸，其中所述T细胞活化结构域包含两个T细胞活化基序。8.一种真核表达载体，包含权利要求1
‑
7任一项的多核苷酸。9.一种制备靶向uPAR阳性细胞的的T细胞的方法，包括用权利要求8的载体转化T细胞。10.权利要求9的方法，进一步包括从外周血单个核细胞(PBMC)分离T细胞。11.权利要求9或10的方法，进一步包括体外扩增T细胞。12.一种靶向uPAR阳性细胞的T细胞，通过权利要求9
‑
11任一项的方法获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡守锋，叶学帅，张孟雅，
申请(专利权)人：浓孚雨医药河北股份有限公司，
类型：发明
国别省市：