用于检测腺相关病毒(AAV)载体转导的增强子和抑制剂和/或检测或定量抗AAV结合抗体的体外测定制造技术

本文公开了用于分析或检测来自受试者的生物样品中腺相关病毒(AAV)载体细胞转导的非抗体抑制剂和/或增强子的存在的方法。本文还公开了用于分析或检测抑制、降低或减少来自受试者的生物样品中的AAV载体细胞转导的AAV结合抗体的存在的方法。这些方法部分依赖于使用空衣壳AAV颗粒来吸收AAV结合抗体，以检测在分析AAV中和抗体(NAb)的生物样品中的AAV载体细胞转导的增强子或抑制剂(当存在时)。胞转导的增强子或抑制剂(当存在时)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测腺相关病毒(AAV)载体转导的增强子和抑制剂和/或检测或定量抗AAV结合抗体的体外测定
相关申请
[0001]本申请要求于2018年11月16日申请的美国临时专利申请No.62/768,665的优先权。上述引用的申请其全部公开内容(包括所有文本、表格、序列表和附图)都通过引用合并于此。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(AAV)载体基因转移已证明在治疗Leber先天性黑蒙和用于出血性疾病A和B的人类临床试验中具有临床功效。由于暴露于野生型AAV，不同百分比的人类将呈现与衣壳结合的抗体，其可抑制或阻止AAV载体细胞转导。这种与AAV结合的抗体是基于AAV的基因治疗载体的主要障碍，从而使一些患者无法获得可能挽救生命的疗法。因此，对于AAV的中和抗体(NAb)呈阳性的受试者通常被排除在基因治疗试验之外，并且也不是基因治疗的最佳候选者。
[0003]抗AAV抗体可以用结合测定法测量，其中检测与病毒结合的IgG，或用细胞转导抑制测定法测量，其中在体外测量报道载体的细胞转导效率。虽然抗体结合测定法很容易设置，但它们无法确定哪些结合抗体会影响AAV载体转导。相反，基于细胞的NAb测定确实测量了由抗AAV循环因子介导的载体转导的抑制程度，但既耗时又在灵敏度和准确性方面存在挑战。此外，Nab测定法的程序缺乏标准化是解释基因治疗试验结果的障碍。

技术实现思路

[0004]如本文所公开的，存在不同于AAV结合抗体的其他因子，其可以抑制、降低或减少AAV载体细胞转导。如本文还公开的，存在可以增强AAV载体细胞转导的因子。这些增强和抑制因子可以存在于适合用基于AAV的基因疗法治疗或参与基于AAV的基因疗法临床试验的某些受试者中。通常，评估受试者是否存在AAV结合抗体，以确定基因疗法治疗的适用性/资格。还可以在接受基因疗法治疗后评估受试者是否存在AAV结合抗体，以监测抗体的发展或基因疗法治疗的后续重新给药。然而，如果需要测量AAV结合抗体的受试者具有AAV载体细胞转导的增强剂或抑制剂，则典型的基于细胞的抗体测定法将提供不准确的关于AAV结合抗体滴度的定量结果。
[0005]例如，在具有AAV结合抗体的受试者中存在增强AAV载体细胞转导的因子的情况下，AAV结合抗体的量将被低估，并且如果足够低会导致受试者中AAV结合抗体的假阴性。这种假阴性受试者实际上对AAV结合抗体呈阳性。
[0006]在受试者中存在抑制AAV载体细胞转导的因子的情况下，即使没有可检测的AAV结合抗体，如果存在足够的抑制剂来抑制或减少AAV载体细胞转导，该测试将导致受试者中AAV结合抗体的假阳性。这类假阳性受试者实际上对AAV结合抗体呈阴性或具有相对较低的AAV抗体滴度。
[0007]因此，本专利技术尤其提供了分析样品中是否存在此类增强因子或抑制因子的方法和
检测样品在样品中存在的此类增强因子或抑制因子的方法。所述样品例如来自受试者的生物样品。
[0008]在某些实施方案中，一种用于分析或检测来自受试者的生物样品中存在腺相关病毒(AAV)载体细胞转导的增强子的方法，其包括：(a)提供a.包含重组AAV载体的感染性重组AAV颗粒，所述重组AAV载体包含报道转基因，所述报道转基因与一种或多种表达调控元件能操作地连接；b.空衣壳AAV颗粒，c.允许AAV感染的细胞和d.来自受试者的生物样品；(b)通过以下方式进行第一次测定：a.在使得所述细胞被所述感染性重组AAV颗粒转导，并且所述报道转基因由所述细胞表达的条件下，使所述细胞与所述感染性重组AAV颗粒接触；以及b.测量所述报道转基因的表达并且确定表示为MAX的值；(c)通过以下方式进行第二次测定：a.将所述生物样品与空衣壳AAV颗粒混合以产生混合物(M)，并且在使得所述空衣壳AAV颗粒能结合所述生物样品中存在的任何AAV结合抗体的条件下孵育所述M；b.在使得所述细胞被感染性重组AAV颗粒转导且报道转基因由所述细胞表达的条件下，使所述细胞接触所述M和所述感染性重组AAV颗粒；以及c.测量所述报道转基因的表达并且确定表示为S.EV的值；以及(d)将所述S.EV与所述MAX进行比较，其中如果所述S.EV大于所述MAX，则来自所述受试者的生物样品包含AAV载体细胞转导的增强子。
[0009]在某些实施方案中，一种用于分析或检测来自受试者的生物样品中存在腺相关病毒(AAV)载体细胞转导的抑制剂的方法，其包括：(a)提供a.包含重组AAV载体的感染性重组AAV颗粒，所述重组AAV载体包含报道转基因，所述报道转基因与一种或多种表达调控元件能操作地连接；b.空衣壳AAV颗粒，c.允许AAV感染的细胞和d.来自受试者的生物样品；(b)通过以下方式进行第一次测定：a.在使得所述细胞被所述感染性重组AAV颗粒转导，并且所述报道转基因由所述细胞表达的条件下，使所述细胞与所述感染性重组AAV颗粒接触；以及b.测量所述报道转基因的表达并且确定表示为MAX的值；(c)通过以下方式进行第二次测定：a.将所述生物样品与空衣壳AAV颗粒混合以产生混合物(M)，并且在使得所述空衣壳AAV颗粒能结合所述生物样品中存在的任何AAV结合抗体的条件下孵育所述M；b.在使得所述细胞被感染性重组AAV颗粒转导且报道转基因由所述细胞表达的条件下，使所述细胞接触所述M和所述感染性重组AAV颗粒；以及c.测量所述报道转基因的表达并且确定表示为S.EV的值；以及(d)将所述S.EV与所述MAX进行比较，其中如果所述S.EV小于所述MAX，则来自所述受试者的生物样品包含AAV载体细胞转导的抑制剂。
[0010]在某些实施方案中，一种用于分析或检测来自受试者的生物样品中存在腺相关病毒(AAV)载体细胞转导的增强子的方法，其包括：(a)提供包含重组AAV载体的感染性重组AAV颗粒，其中(i)载体包含报道转基因，(ii)报道转基因包含单链或自互补基因组，(iii)报道转基因是与一种或多种表达调控元件可操作地连接的，并且(iv)报道转基因的侧翼是一个或多个侧翼元件；(b)提供能被感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(c)在使得(b)的细胞被(a)的感染性重组AAV颗粒转导且报道转基因由(b)的细胞
表达的条件下，使(b)的细胞与(a)的感染性重组AAV颗粒接触；(d)测量报道转基因的表达并且确定反映(c)的报道转基因表达的量的表示为MAX的值；(e)提供感染性重组AAV颗粒(a)；(f)提供来自受试者的生物样品；(g)提供能被感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(h)将(f)的生物样品与空衣壳AAV颗粒混合以产生混合物(M)并且在使得空衣壳AAV颗粒能与生物样品中存在的任何AAV结合抗体结合的条件下孵育M；(i)在使得(e)的感染性重组AAV颗粒能转导(g)的细胞并表达(g)的细胞的报道转基因的条件下，使(g)的细胞与M和(e)的感染性重组AAV颗粒接触；(j)测量报道转基因的表达并且确定反映(i)的报道转基因表达的量的表示为S.EV的值；以及(k)将S.EV与MAX进行比较，其中如果S.EV大于MAX，则来自受试者的生物样品包含AAV载体细胞转导的增强子。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于分析或检测来自受试者的生物样品中存在腺相关病毒(AAV)载体细胞转导的增强子的方法，其包括：(a)提供包含重组AAV载体的感染性重组AAV颗粒，其中(i)所述载体包含报道转基因，(ii)所述报道转基因包含单链或自互补基因组，(iii)所述报道转基因与一种或多种表达调控元件能操作地连接；和(iv)所述报道转基因的侧翼是一个或多个侧翼元件；(b)提供能被所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(c)在使得(b)的所述细胞被(a)的所述感染性重组AAV颗粒转导且所述报道转基因由(b)的所述细胞表达的条件下，使(b)的所述细胞与(a)的所述感染性重组AAV颗粒接触；(d)测量所述报道转基因的表达并且确定反映(c)的报道转基因表达的量的表示为MAX的值；(e)提供(a)的感染性重组AAV颗粒；(f)提供受试者的生物样品；(g)提供能被所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(h)将(f)的所述生物样品与空衣壳AAV颗粒混合以产生混合物(M)并在使得所述空衣壳AAV颗粒能结合所述生物样品中存在的任何AAV结合抗体的条件下孵育所述M；(i)在使得(e)的所述感染性重组AAV颗粒能转导(g)的所述细胞并在(g)的所述细胞中表达所述报道转基因的条件下，使(g)的所述细胞接触所述M和(e)的所述感染性重组AAV颗粒；(j)测量所述报道转基因的表达并且确定反映(i)的报道转基因表达的量的表示为S.EV的值；(k)将所述S.EV与所述MAX进行比较，其中如果所述S.EV大于所述MAX，则来自所述受试者的生物样品包含AAV载体细胞转导的增强子。2.一种用于分析或检测来自受试者的生物样品中存在腺相关病毒(AAV)载体细胞转导的抑制剂的方法，其包括：(a)提供包含重组AAV载体的感染性重组AAV颗粒，其中(i)所述载体包含报道转基因，(ii)所述报道转基因包含单链或自互补基因组，(iii)所述报道转基因与一种或多种表达调控元件能操作地连接；和(iv)所述报道转基因的侧翼是一个或多个侧翼元件；(b)提供能被所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(c)在使得(b)的所述细胞被(a)的所述感染性重组AAV颗粒转导且所述报道转基因由(b)的所述细胞表达的条件下，使(b)的所述细胞与(a)的所述感染性重组AAV颗粒接触；(d)测量所述报道转基因的表达并且确定反映(c)的报道转基因表达的量的表示为MAX的值；(e)提供(a)的感染性重组AAV颗粒；(f)提供受试者的生物样品；(g)提供能被所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；
(h)将(f)的所述生物样品与空衣壳AAV颗粒混合以产生混合物(M)并在使得所述空衣壳AAV颗粒能结合所述生物样品中存在的任何AAV结合抗体的条件下孵育所述M；(i)在使得(e)的所述感染性重组AAV颗粒能转导(g)的所述细胞并在(g)的所述细胞中表达所述报道转基因的条件下，使(g)的所述细胞接触所述M和(e)的所述感染性重组AAV颗粒；(j)测量所述报道转基因的表达并且确定反映(i)的报道转基因表达的量的表示为S.EV的值；(k)将所述S.EV与所述MAX进行比较，其中如果所述S.EV小于所述MAX，则来自所述受试者的生物样品包含AAV载体细胞转导、由所述载体编码的蛋白质的表达或分泌的抑制剂。3.一种用于分析或检测来自受试者的生物样品中存在腺相关病毒(AAV)载体细胞转导的增强子的方法，其包括：(a)提供包含重组AAV载体的感染性重组AAV颗粒，其中(i)所述载体包含报道转基因，(ii)所述报道转基因包含单链或自互补基因组，(iii)所述报道转基因与一种或多种表达调控元件能操作地连接；和(iv)所述报道转基因的侧翼是一个或多个侧翼元件；(b)提供能被所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(c)提供受试者的生物样品；(d)将(c)的所述生物样品与空衣壳AAV颗粒混合以产生混合物(M)并在使得所述空衣壳AAV颗粒能结合所述生物样品中存在的任何AAV结合抗体的条件下孵育所述M；(e)在使得(a)的所述感染性重组AAV颗粒能转导(b)的所述细胞并在(b)的所述细胞中表达所述报道转基因的条件下，使(b)的所述细胞接触所述M和(a)的所述感染性重组AAV颗粒；(f)测量所述报道转基因的表达；(g)将(f)的所述表达与阳性(+)对照进行比较，其中所述+对照是在没有来自所述受试者的所述样品并且没有添加所述空衣壳AAV颗粒的情况下所述报告基因转基因的表达，其中如果(f)的表达大于所述+对照，则来自所述受试者的生物样品包含AAV载体细胞转导的增强子。4.一种用于分析或检测来自受试者的生物样品中存在腺相关病毒(AAV)载体细胞转导的抑制剂的方法，其包括：(a)提供包含重组AAV载体的感染性重组AAV颗粒，其中(i)所述载体包含报道转基因，(ii)所述报道转基因包含单链或自互补基因组，(iii)所述报道转基因与一种或多种表达调控元件能操作地连接；和(iv)所述报道转基因的侧翼是一个或多个侧翼元件；(b)提供能被所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(c)提供受试者的生物样品；(d)将(c)的所述生物样品与空衣壳AAV颗粒混合以产生混合物(M)并在使得所述空衣壳AAV颗粒能结合所述生物样品中存在的任何AAV结合抗体的条件下孵育所述M；
(e)在使得(a)的所述感染性重组AAV颗粒能转导(b)的所述细胞并在(b)的所述细胞中表达所述报道转基因的条件下，使(b)的所述细胞接触所述M和(a)的所述感染性重组AAV颗粒；(f)测量所述报道转基因的表达；(g)将(f)的所述表达与阳性(+)对照进行比较，其中所述+对照是在没有来自所述受试者的所述样品并且没有添加所述空衣壳AAV颗粒的情况下所述报告基因转基因的表达，其中如果(f)的表达小于所述+对照，则来自所述受试者的生物样品包含AAV载体细胞转导的抑制剂。5.一种用于分析、检测或定量来自受试者的生物样品中的抑制AAV载体细胞转导的AAV结合抗体的方法，其包括：(a)提供包含重组AAV载体的感染性重组AAV颗粒，其中(i)所述载体包含报道转基因，(ii)所述报道转基因包含单链或自互补基因组，(iii)所述报道转基因与一种或多种表达调控元件能操作地连接；和(iv)所述报道转基因的侧翼是一个或多个侧翼元件；(b)提供能被所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(c)在使得(b)的所述细胞被(a)的所述感染性重组AAV颗粒转导且所述报道转基因由(b)的所述细胞表达的条件下，使(b)的所述细胞与(a)的所述感染性重组AAV颗粒接触；(d)测量所述报道转基因的表达并且确定反映(c)的报道转基因表达的量的表示为MAX的值；(e)提供(a)的感染性重组AAV颗粒；(f)提供受试者的稀释生物样品；(g)提供能被所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(h)将(f)的所述稀释生物样品与空衣壳AAV颗粒混合以产生混合物(M)并在使得所述空衣壳AAV颗粒能结合所述稀释生物样品中存在的任何AAV结合抗体的条件下孵育所述M；(i)在使得(e)的所述感染性重组AAV颗粒能转导(g)的所述细胞并在(g)的所述细胞中表达所述报道转基因的条件下，使(g)的所述细胞接触所述M和(e)的所述感染性重组AAV颗粒；(j)测量所述报道转基因的表达并且确定反映(i)的报道转基因表达的量的表示为S.EV的值；(k)提供(a)的感染性重组AAV颗粒；(l)提供来自提供(f)的所述样品的相同受试者的稀释生物样品；(m)提供能被所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；(n)将(l)的所述稀释生物样品与(k)的所述感染性重组AAV颗粒混合以产生混合物(M)；(o)在使得(k)的所述感染性重组AAV颗粒能转导(m)的所述细胞并在(m)的所述细胞中表达所述报道转基因的条件下，使(m)的所述细胞与所述M接触；(p)测量所述报道转基因的表达并且确定反映(o)的报道转基因表达的量的表示为S的值；
(q)在不同的样品稀释度下执行步骤(h)
–
(j)和(n)
–
(p)至少两次；(r)其中如果S小于MAX并且S.EV等于或大于MAX，则抑制AAV载体细胞转导的AAV结合抗体存在于所述稀释的生物样品中；并且，任选地(s)测量能被(a)的所述感染性重组AAV颗粒感染但未被(a)的所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞的阴性对照的表达以提供表示为MIN的背景值，其中MIN能从S、MAX和/或S.EV中的任何一项中减去。6.根据权利要求5所述的方法，其还包括在步骤(r)或步骤(s)之后，计算所述生物样品中的AAV结合抗体的滴度，所述滴度对应于提供对报道转基因表达的约50％或更多的抑制，其中如果提供对报道转基因表达的约50％或更多的抑制的最低稀释度大于或等于约1:5，则所述滴度是通过公式S/MAX确定的提供约50％或更多的抑制的稀释度，或其中如果提供对报道转基因表达的约50％或更多的抑制的最低稀释度小于约1:5，则所述滴度是通过公式S/S.EV确定的提供约50％或更多的抑制的稀释度。7.根据权利要求5所述的方法，其还包括步骤(t)，计算所述生物样品中的AAV结合抗体的滴度，所述滴度对应于提供对报道转基因表达的约50％或更多的抑制，其中如果提供对报道转基因表达的约50％或更多的抑制的最低稀释度大于或等于约1:5，则所述滴度是通过公式100
‑
[[(S
‑
MIN)/(MAX
‑
MIN)]
×
100]确定的提供约50％或更多的抑制的稀释度，或其中如果提供对报道转基因表达的约50％或更多的抑制的最低稀释度小于约1:5，则所述滴度是通过公式100
‑
[[(S
‑
MIN)/(S.EV
‑
MIN)]
×
100]确定的提供约50％或更多的抑制的稀释度。8.根据权利要求5
‑
7中任一项所述的方法，其还包括：提供(a)的感染性重组AAV颗粒；提供能用所述感染性重组AAV颗粒感染的细胞；提供空衣壳AAV颗粒；使所述细胞与所提供的所述空衣壳AAV颗粒接触；在使得(b)的所述细胞被(a)的所述感染性重组AAV颗粒转导且所述报道转基因由所述细胞表达的条件下，使已经与所述空衣壳AAV颗粒接触的所述细胞与(a)的所述感染性重组AAV颗粒接触；测量所述报道基因的表达并且确定反映报道基因的表达量的表示为MAX.EV的值。9.根据权利要求5
‑
8中任一项所述的方法，其还包括计算信噪比，该信噪比表示为S/N，其中S/N＝MAX/MIN。10.根据权利要求5
‑
9中任一项所述的方法，其还包括计算变异系数百分比(％CV)，其中％CV＝(标准偏差/平均值)
×
100％。11.根据权利要求5
‑
10中任一项所述的方法，其还包括计算EV干扰，其中EV干扰＝MAX/MAX.EV。12.根据权利要求5
‑
12中任一项所述的方法，其还包括：(a)在包含与AAV载体结合的AAV结合抗体的一种或多种稀释度的对照条件下测量所述报道基因的表达，并且为相对于MAX或MAX
‑
MIN提供预选量的报道转基因表达的所述稀释度的表达测量值确定表示为HQC的值；和/或(b)在包括在空衣壳AAV颗粒的存在下步骤(a)的相对于MAX或MAX
‑
MIN提供预选量的报
道转基因表达的所述稀释度的对照条件下测量所述报道转基因的表达，并且确定表示为HQC.EV的值。13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(a)的所述报道转基因表达的预选量等于或小于MAX或MAX
‑
MIN的约30％。14.根据权利要求12或13所述的方法，其还包括计算EV功效，其中EV功效＝HQC.EV/HQC。15.根据权利要求5
‑
13中任一项所述的方法，其中步骤(h)
‑
(j)和(n)
‑
(p)在所述生物样品的3、4、5或6种不同稀释度下执行至少3、4、5或6次。16.根据权利要求5
‑
14中任一项所述的方法，其中在与(a)、(e)或(k)的所述感染性重组AAV颗粒接触或一起孵育之前，将所述生物样品稀释至介于约1:1至约1:1000之间。17.根据权利要求5
‑
16中任一项所述的方法，其中步骤(h)
‑
(j)和(n)
‑
(p)以所述生物样品的约1:1、约1:2.5、约1:5、约1:10、约1:100和/或约1:1000的稀释度执行。18.根据权利要求1
‑
16中任一项所述的方法，其中所述方法在步骤(c)或(d)的约48小时内完成。19.根据权利要求1
‑
18中任一项所述的方法，其中从冷冻细胞等分试样接种能被所述感染性重组AAV颗粒感染的所述细胞。20.根据权利要求1
‑
19中任一项所述的方法，其中，步骤(c)、(e)、(i)或(o)中任一项的能被所述感染性重组AAV颗粒感染的所述细胞在其从冷冻中解冻后约2小时内接触。21.根据权利要求1
‑
20中任一项所述的方法，其中步骤(c)、(e)、(i)或(o)中任一项的能被所述感染性重组AAV颗粒感染的所述细胞是至少约80％汇合。22.一种载具或板，其上单独布置有：(a)能被包含报道转基因的感染性重组AAV颗粒感染的细胞、和包含所述报道转基因的所述感染性重组AAV颗粒；(b)来自受试者的稀释生物样品、能被感染性重组AAV颗粒感染的细胞、和空衣壳AAV颗粒；和(c)来自(b)的提供所述样品的相同受试者的稀释生物样品、能被包含报道转基因的感染性重组AAV颗粒感染的细胞、和包含所述报道转基因的所述感染性重组AAV颗粒。23.根据权利要求22所述的载具或板，其中所述载具或板包括塑料或玻璃。24.根据权利要求22或23所述的载具或板，其中所述载具或板是多孔板或盘。25.根据权利要求22
‑
24中任一项所述的载具或板，其中(a)、(b)和(c)中的每一者被布置在多孔载具或板的单独的管或单独的单孔内。26.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中能被所述感染性重组AAV颗粒感染的所述细胞包括哺乳动物细胞。27.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中所述细胞能被包含与AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV3B、AAV
‑
2i8、Rh74、Rh10、SPK1(SEQ ID NO:1)、SPK2(SEQ ID NO:2)或任何一种前述AAV血清型的杂交体或嵌合体的VP1、VP2或VP3序列具有90％或更多的同一性的VP1、VP2或VP3序列的AAV颗粒感染。28.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载
具或板，其中所述细胞能被AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV3B、AAV
‑
2i8、Rh74、Rh10、SPK1(SEQ ID NO:1)、SPK2(SEQ ID NO:2)或任何前述AAV血清型的杂交体或嵌合体感染。29.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中能被所述感染性重组AAV颗粒感染的所述细胞包含2V6.11、HEK
‑
293、CHO、BHK、MDCK、10T1/2、WEHI cells、COS、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、MRC5、A549、HT1080、B
‑
50、3T3、NIH3T3、HepG2、Saos
‑
2、Huh7、HER、HEK、HEL或HeLa细胞，任选地其中任何所述细胞表达腺病毒E4基因。30.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中所述报道转基因编码分泌或可分泌的蛋白。31.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中所述报道转基因编码提供酶促、比色、荧光、发光、化学发光或电化学信号的蛋白。32.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中所述报道转基因包含荧光素酶基因。33.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中所述报道转基因包括海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶或高斯荧光素酶基因。34.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中所述报道转基因包含β
‑
半乳糖苷酶基因、β
‑
葡萄糖醛酸酶基因或氯霉素转移酶基因。35.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中所述报道转基因编码绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或碱性磷酸酶。36.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中所述表达调控元件包含能在哺乳动物细胞中操作的启动子和/或增强子核酸序列。37.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
‑
25中任一项所述的载具或板，其中所述表达调控元件包含CAG(SEQ ID NO:3)、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子/增强子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、鸡β
‑
肌动蛋白(CBA)启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子或延伸因子
‑
1α(EF1
‑
α)启动子。38.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的方法或根据权利要求22
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25中任一项所述的载具或板，其中所述侧翼元件包含一个或多个AAV反向末端重复序列(ITR)。39.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法或根据权利要求22
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25中任一项所述的载具或板，其中所述报道转基因位于一个或多个5'和/或3'AAVITR之间。40.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法或根据权利要求22
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25中任一项所述的载具或板，其中所述侧翼元件包含不被AAV Rep蛋白加工的突变、修饰或变体AAV ITR。41.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法或根据权利要求22
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25中任一项所述的载具或板，其中所述侧翼元件包括在所述感染性重组AAV颗粒中，允许或促进自互补报道转基因基因组形成双链反向重复序列结构的突变、修饰或变体AAV ITR。42.权利要求1
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21中任一项所述的方法或根据权利要求22
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25中任一项所述的载具或
板，其中所述突变、修饰或变体AAV ITR具有缺失的D序列，和/或突变、修饰或变体末端解析位点(TRS)序列。43.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法或根据权利要求22
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25中任一项所述的载具或板，其中所述重组载体包含AAV的第一反向末端重复序列(ITR)；在哺乳动物细胞中能操作的启动子；所述报道转基因；聚腺苷酸化信号；以及任选的AAV的第二个ITR。44.权利要求1
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21中任一项所述的方法或根据权利要求22
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25中任一项所述的载具或板，其中所述重组载体包含使得能将所述报道转基因插入能在哺乳动物细胞中操作的启动子下游的限制性位点和所述限制性位点下游的转录后调控元件，其中所述启动子、所述限制性位点和所述转录后调控元件位于5'AAV ITR的下游和任选的3'AAV ITR的上游。45.根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：克劳迪亚，
申请(专利权)人：星火治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：