最优化启动子序列、无内含子的表达结构及使用方法技术

本发明专利技术提供了表达盒。在某些实施方案中，表达盒包含(a)与SEQ IDNO:2‑67中的任一者的序列至少90％相同的调节元件，以及(b)编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII‑BDD)的核酸序列，其中该(a)的核酸序列与SEQ ID NO:77的序列至少90％相同，其中该调节元件可操作地连接至该核酸序列，且其中在该调节元件与编码FVIII‑BDD的该核酸序列之间不存在内含子，或其中未翻译的核酸的不超过0‑107个核苷酸在该调节元件与编码FVIII‑BDD的该核酸序列之间。在某些实施方案中，表达盒含有使CpG在相同位置处经CpT、CpA、TpG或ApG取代的序列元件或具有CpG减少的核酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】最优化启动子序列、无内含子的表达结构及使用方法相关申请本申请要求2018年8月24日提交的美国临时专利申请No.62/722,547、2018年8月30日提交的美国临时专利申请No.62/725,096、以及2018年12月21日提交的美国临时专利申请No.62/784,116的优先权。上述申请的全部内容(包括所有文本、表格、序列表和附图)通过引用并入本文。
技术介绍
基因疗法在涉及例如归因于基因缺乏或缺陷而丧失蛋白功能或活性或需要遏制异常蛋白的表达的蛋白的异常功能或活性的治疗应用中显示极大前景。转基因表达、驱动转基因表达的增强子和启动子功能的改善将增强基因疗法治疗应用。本专利技术尤其解决该需求。
技术实现思路
根据本专利技术，提供了包含编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列的表达盒。在某些实施方案中，表达盒包含与SEQIDNO:1的序列至少98％相同的序列，与SEQIDNO:1的序列至少99％相同，包含SEQIDNO:1的序列，或由SEQIDNO:1的序列组成。在某些实施方案中，表达盒包含可操作地连接至编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列的调节元件，其中在该调节元件与该核酸序列之间不存在内含子，并且其中表达盒包含与SEQIDNO:1的序列至少91％相同的序列。在某些实施方案中，表达盒包含(a)与SEQIDNO:2-67中的任一者的序列至少90％相同的调节元件，以及(b)编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中(a)的核酸序列与SEQIDNO:77的序列至少90％相同，并且其中调节元件可操作地连接至核酸序列，并且其中在调节元件与编码FVIII-BDD的核酸序列之间不存在内含子。在某些实施方案中，表达盒包含(a)与SEQIDNO:2-67中的任一者的序列至少90％相同的调节元件，以及(b)编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中核酸序列与SEQIDNO:77的序列至少90％相同，并且其中调节元件可操作地连接至核酸序列，并且其中未翻译的核酸的不超过0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107个核苷酸在调节元件与编码FVIII-BDD的核酸序列之间。在某些实施方案中，表达盒中的调节元件包含与SEQIDNO:2-67中的任一者至少95％相同的核苷酸序列。在某些实施方案中，表达盒中的调节元件具有与SEQIDNO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述的相同总数目的减少的CpG。在某些实施方案中，表达盒中的调节元件包含SEQIDNO:2-21或24-67中的任一者的序列，其使CpG在与SEQIDNO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述的相同的位置处被取代成CpT、CpA、TpG或ApG。在某些实施方案中，表达盒中的核酸序列在与来自在调节元件与核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒的表达相比时呈现更高的表达。在某些实施方案中，表达盒中的经编码的FVIII-BDD与来自在调节元件与核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒的表达相比呈现更大的生物活性。在某些实施方案中，生物活性通过凝固检定或FVIII检定或FVIII缺乏模型中的减少出血来测定。在某些实施方案中，表达盒在与包装在调节元件与核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒相比时更有效地包装至AAV载体中。根据本专利技术，提供了调节元件(启动子)的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)减少的核酸序列。示例性的启动子包括TTR(甲状腺素转运蛋白基因)启动子和ApoE/hAAT(人类载脂蛋白E基因/人类α-1抗胰蛋白酶基因)启动子。示例性启动子还包括血纤维蛋白原γ链基因(FGG)启动子、白蛋白启动子及血清淀粉样蛋白A1基因(SAA1)启动子。示例性启动子进一步包括稠合至hAAT启动子、FGG启动子、白蛋白启动子和/或SAA1启动子中的一或多者(产生杂合启动子或启动子嵌合体)的TTR启动子。CpG减少的核酸调节元件包括在转移至细胞中时与非CpG减少的调节元件相比呈现经改变的基因表达水平的变体。在某些实施方案中，CpG减少的调节元件可提供转基因或异源核酸(诸如编码诸如血液凝固因子(例如，FVIII)的蛋白的转基因)在哺乳动物中的经增加的表达，以及在基因转移的内容背景中通过增加诸如血液凝固因子之类的蛋白的循环水平，且实现止血以获得有益治疗结果来提供经增加的疗效。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:2、3、22和23中的任一者)少至少1个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:2、3、22和23中的任一者)少至少2个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:2、3、22和23中的任一者)少至少3个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:2、3、22和23中的任一者)少至少4个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:22和23中的任一者)少至少5个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:22和23中的任一者)少至少6个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:22和23中的任一者)少至少7个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:22和23中的任一者)少至少8个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:22和23中的任一者)少至少9个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:22和23中的任一者)少至少10个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:22和23中的任一者)少至少11个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:22和23中的任一者)少至少12个。在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQIDNO:22和23中的任一者)少至少13个。在某些实施方案中，核酸序列具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达盒，其包含编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中所述表达盒包含与SEQ ID NO:1的序列至少98％相同的序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180824 US 62/722,547;20180830 US 62/725,096;20181.一种表达盒，其包含编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中所述表达盒包含与SEQIDNO:1的序列至少98％相同的序列。


2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒包含与SEQIDNO:1的序列至少99％相同的序列。


3.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒包含SEQIDNO:1的序列。


4.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒由SEQIDNO:1的序列组成。


5.一种表达盒，其包含能操作地连接至编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列的调节元件，其中在所述调节元件与所述核酸序列之间不存在内含子，并且其中所述表达盒包含与SEQIDNO:1至少91％相同的序列。


6.一种表达盒，其包含：
a.调节元件，其与SEQIDNO:2-67中的任一者的序列至少90％相同，以及
b.核酸序列，其编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)，所述核酸序列与SEQIDNO:77的序列具有至少90％的一致性，
其中所述调节元件能操作地连接至所述核酸序列，且其中在所述调节元件与所述核酸序列之间不存在内含子。


7.一种表达盒，其包含：
a.调节元件，其与SEQIDNO:2-67中的任一者的序列至少90％相同，以及
b.核酸序列，其编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)，所述核酸序列与SEQIDNO:77的序列具有至少90％的一致性，
其中所述调节元件能操作地连接至所述核酸序列，且其中未翻译的核酸的不超过0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107个的核苷酸在所述调节元件与所述核酸序列之间。


8.根据权利要求5至7中任一项所述的表达盒，其中所述调节元件包含与SEQIDNO:2-67中的任一者至少95％相同的核苷酸序列。


9.根据权利要求5至8中任一项所述的表达盒，其中所述调节元件具有与SEQIDNO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述的相同总数目的减少的CpG。


10.根据权利要求5至9中任一项所述的表达盒，其中所述调节元件包含SEQIDNO:2-21或24-67中的任一者的序列，其使CpG在与SEQIDNO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述的相同位置处被取代成CpT、CpA、TpG或ApG。


11.根据权利要求5至10中任一项所述的表达盒，其中所述核酸序列在与来自在所述调节元件与所述核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒的表达相比时呈现更大的表达。


12.根据权利要求5至11中任一项所述的表达盒，其中所述经编码的FVIII-BDD在与来自在所述调节元件与所述核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒的表达相比时呈现更大的生物活性。


13.根据权利要求12所述的表达盒，其中生物活性通过凝固检定或FVIII检定或FVIII缺乏模型中的减少出血来测定。


14.根据权利要求5至13中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒在与包装在所述调节元件与所述核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒相比时更有效地包装至AAV载体中。


15.一种核酸序列，其包含被修饰成具有较少胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的SEQIDNO:2、3、22或23。


16.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少1个CpG的SEQIDNO:2、3、22或23。


17.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少2个CpG的SEQIDNO:2、3、22或23。


18.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少3个CpG的SEQIDNO:2、3、22或23。


19.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少4个CpG的SEQIDNO:2、3、22或23。


20.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少5个CpG的SEQIDNO:22或23。


21.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少6个CpG的SEQIDNO:22或23。


22.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少7个CpG的SEQIDNO:22或23。


23.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少8个CpG的SEQIDNO:22或23。


24.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少9个CpG的SEQIDNO:22或23。


25.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少10个CpG的SEQIDNO:22或23。


26.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少11个CpG的SEQIDNO:22或23。


27.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少12个CpG的SEQIDNO:22或23。


28.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少13个CpG的SEQIDNO:22或23。


29.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少14个CpG的SEQIDNO:22或23。


30.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少15个CpG的SEQIDNO:22或23。


31.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少16个CpG的SEQIDNO:22或23。


32.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有1或0个CpG的SEQIDNO:2、3、22或23。


33.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有0个CpG的SEQIDNO:2、3、22或23。


34.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:2、3、22或23中的5’端的至少第一个CpG被修饰成不是CpG。


35.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:2、3、22或23中的5’端的至少第二个CpG被修饰成不是CpG。


36.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:2、3、22或23中的5’端的至少第三个CpG被修饰成不是CpG。


37.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:2、3、22或23中的5’端的至少第四个CpG被修饰成不是CpG。


38.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第五个CpG被修饰成不是CpG。


39.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第六个CpG被修饰成不是CpG。


40.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第七个CpG被修饰成不是CpG。


41.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第八个CpG被修饰成不是CpG。


42.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第九个CpG被修饰成不是CpG。


43.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第10个CpG被修饰成不是CpG。


44.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第11个CpG被修饰成不是CpG。


45.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第12个CpG被修饰成不是CpG。


46.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第13个CpG被修饰成不是CpG。


47.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第14个CpG被修饰成不是CpG。


48.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第15个CpG被修饰成不是CpG。


49.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQIDNO:22或23中的5’端的至少第16个CpG被修饰成不是CpG。


50.一种核酸序列，其与根据权利要求15至49中任一项所述的核酸序列的所述序列至少95％相同。


51.一种多核苷酸，其包含与具有或不具有5’和/或3’侧接5-7个核苷酸的SEQIDNO:4-21或24-67中的任一者的序列至少95％相同的核酸序列。


52.一种多核苷酸，其包含与SEQIDNO:4-21或24-67中的任一者的序列至少95％相同且具有与SEQIDNO:4-21或24-67中的任一者中所阐述的相同数目的减少的CpG的核酸序列。


53.一种多核苷酸，其包含与SEQIDNO:4-21或24-67中的任一者的序列至少95％相同且在与SEQIDNO:4-21或24-67中的任一者中所阐述的相同的位置处具有减少的CpG的核酸序列。


54.根据权利要求15至53中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中所述经修饰的SEQIDNO:2、3、22或23使至少一个CpG中的G核苷酸经T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸或使至少一个CpG中的C核苷酸经T或A核苷酸取代成TpG或ApG二核苷酸。


55.根据权利要求15至54中任一项所述的核酸序列或...

【专利技术属性】
技术研发人员：泽维尔·安谷拉，利龙·埃尔库比，
申请(专利权)人：星火治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US