病毒载体编码异构水解醇的相对效力测定制造技术

提供了用于测定异构水解酶蛋白的功能和/或活性和/或效力的方法。

Relative potency determination of isohydrol encoding by virus vectors

A method for determining the function and/or activity and/or potency of isohydrolase proteins is provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】病毒载体编码异构水解醇的相对效力测定相关申请本申请要求于2016年4月28日提交的美国临时专利申请No.62/328,916的优先权。前述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图在内的全部内容通过引用并入本文。引言异构水解酶(isomerohydrolase)活性或效力可以通过定量由这些酶产生的反应产物来测量。本专利技术涉及测量异构水解酶活性和/或效力。
技术实现思路
本专利技术提供了用于测量和/或检测异构水解酶(isomerohydrolase)活性的方法。在某些实施方案中，方法包括使用非放射性异构水解酶底物或异构水解酶底物的前体，并检测通过异构水解酶转化产生的非放射性反应产物。在某些实施方案中，方法包括使用质谱法定量反应产物，从而测量和/或检测异构水解酶活性。在特定的实施方案中，一种测量和/或检测异构水解酶活性的方法，其包括：(a)在允许细胞转导的条件下，使表达卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)的细胞(例如，真核细胞)与包含编码异构水解酶蛋白(例如，RPE65)的转基因的病毒载体(例如，腺相关病毒(AAV)载体)接触；在允许表达所编码的所述异构水解酶蛋白(例如，RPE65)的条件下孵育病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测量异构水解酶活性的方法，其包括：(a)在允许细胞转导的条件下，使表达卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)的细胞与包含编码异构水解酶蛋白的转基因的腺相关病毒(AAV)载体接触；(b)在允许表达所编码的所述异构水解酶蛋白的条件下孵育转导的细胞；(c)收集并裂解转导的所述细胞以产生包含所编码的所述异构水解酶蛋白的提取物；(d)将所述提取物与底物一起孵育一段时间，并在允许所述底物被所述异构水解酶蛋白转化为反应产物的条件下进行；(e)将所述反应产物进行柱色谱法处理，从而产生柱色谱法纯化的反应产物；以及(f)对所述柱色谱法纯化的反应产物进行质谱法处理，从而定量所述反应产物，其中所述反应产物的量反映...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.28 US 62/328,9161.一种测量异构水解酶活性的方法，其包括：(a)在允许细胞转导的条件下，使表达卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)的细胞与包含编码异构水解酶蛋白的转基因的腺相关病毒(AAV)载体接触；(b)在允许表达所编码的所述异构水解酶蛋白的条件下孵育转导的细胞；(c)收集并裂解转导的所述细胞以产生包含所编码的所述异构水解酶蛋白的提取物；(d)将所述提取物与底物一起孵育一段时间，并在允许所述底物被所述异构水解酶蛋白转化为反应产物的条件下进行；(e)将所述反应产物进行柱色谱法处理，从而产生柱色谱法纯化的反应产物；以及(f)对所述柱色谱法纯化的反应产物进行质谱法处理，从而定量所述反应产物，其中所述反应产物的量反映异构水解酶活性，从而测量异构水解酶活性。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含野生型视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含变体或突变体视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含哺乳动物视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含人视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞包含哺乳动物细胞。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞包含人细胞。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞包含人胚肾(HEK)293细胞。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞稳定或瞬时表达LRAT。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述底物包含全反式视黄基酯。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括将所述底物的前体加入到所述提取物中，其中所述前体通过所表达的所述LRAT转化为所述底物。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括向所述提取物中添加细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)和所述底物的前体，其中所述前体通过所表达的所述LRAT转化为所述底物。14.根据权利要求13所述的方法，其中所添加的CRALBP的量介于约50和约500μg之间。15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细胞还稳定或瞬时表达细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)。16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述前体包含全反式视黄醇或由其组成。17.根据权利要求16所述的方法，其中添加所述全反式视黄醇使得最终浓度为约1至约20mM。18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述反应产物包含11-顺式-视黄醇或由其组成。19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(d)、(e)和/或(f)在暗处、在昏暗光下或在暗黄色光下进行。20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述底物、前体或反应产物是非放射性的。21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中步骤(d)的时间为约30分钟至约240分钟。22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后但在步骤(e)之前停止或淬灭所述反应。23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后但在步骤(e)之前加入醇。24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中步骤(d)还包括提取所述反应产物。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述反应产物用有机溶剂提取。26.根据权利要求24所述的方法，其中所述反应产物用己烷提取。27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(d)中的任何...

【专利技术属性】
技术研发人员：琳达·科托，
申请(专利权)人：星火治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US