生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体制造技术

提供了以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法。还提供了将rAAV载体浓缩至高浓度的方法，例如，高达5E+13(5×10

Producing high-yielding recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector, expandable high-recovery method and recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector

A method for producing recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector particles with high recovery or high titer is provided. A method for concentrating rAAV carriers to high concentrations is also provided, for example, up to 5E+13 (5*10).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体相关申请本申请要求于2016年7月21日提交的美国临时专利申请No.62/365,312的优先权。前述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图在内的全部内容通过引用并入本文。引言切向流过滤(TFF)是生物技术工业中使用的技术，其通过超滤过程(UF)浓缩产物并通过渗滤(DF)进行缓冲液交换以配制产物。然而，当TFF用于进行重组腺相关病毒(rAAV)载体的UF/DF时，在该过程中丢失了大量的rAAV载体。当rAAV载体高度浓缩时，甚至会丢失更多的载体。在UF/DF过程中损失的载体量使得几乎不可能制备高浓度的rAAV载体制备物，这在rAAV相关基因治疗产物的开发中是非常需要的。在rAAV载体的制造中经常观察到的另一种现象是rAAV载体倾向于在UF/DF过程中聚集，特别是当载体制备物高度浓缩时，例如1E+13vg/ml(1×1013载体基因组/ml；vg：载体基因组)或更高。rAAV载体聚集似乎依赖于滴度，滴度越高，则载体聚集越多。载体聚集还导致制造期间的载体损失。此外，当在临床中使用时，聚集的载体是患者安全性的关注点。在使用上述TFF技术的UF/DF过程中，rAAV载体聚集和载体丢失的问题代表了rAAV载体的制备和/或纯化中的重要过程挑战。本专利技术解决了这些问题。
技术实现思路
在许多不同的假设中，在使用TFF技术的UF/DF过程中的rAAV载体聚集和载体丢失可以是过程依赖性的和/或制剂依赖性的。基于这样的假设，设计了新的制剂并为UF/DF过程创建了新的操作参数，以改善载体回收率并减少、最小化或防止rAAV载体聚集。在用于UF/DF过程的专利技术配方和操作参数中，rAAV载体恢复得到改善并且rAAV载体聚集减少。本文公开的数据显示，单独或组合地为UF/DF过程创建的新制剂和操作参数使得从初始rAAV载体制备中回收的总体rAAV载体的显著增加。事实上，rAAV载体可以浓缩至5E+13vg/ml(5×1013载体基因组/ml)而没有显著的载体损失，并且载体主要是单体，从而表明聚集减少。本文公开的专利技术制剂和/或操作参数将使rAAV载体能够浓缩至高浓度，例如高达5E+13(5×1013)载体基因组/毫升(Vg/ml)，几乎没有任何rAAV聚集体。此外，本文公开的专利技术制剂和/或操作参数将改善来自缓冲液交换的rAAV载体回收或使用切向流过滤技术(TFF)浓缩载体。当需要高浓度的rAAV制备物时，本文公开的专利技术制剂和/或操作参数可以支持使用rAAV载体的任何基因疗法临床应用，例如用于溶酶体贮积病(例如神经元蜡样脂褐质沉积症2(CLN2))的rAAV介导的基因疗法，用于血液凝固缺陷(血友病A和血友病B)的rAAV介导的基因疗法等。通过使用TFF的超滤(UF)和渗滤(DF)过程的改进的载体回收也将降低rAAV载体制造的商品的成本，并且还提供更稳健和一致的rAAV载体或临床应用。因此，本专利技术为rAAV制造过程提供了各种益处。在一实施方案中，rAAV载体回收增强，并且可以显著增强，从而从开始到结束提供改善的产量(例如，从开始到结束提供70％或更高的rAAV载体产量)。在另一实施方案中，减少、最小化或预防rAAV聚集，特别是当rAAV载体浓缩至高rAAV载体滴度时。在进一步的实施方案中，rAAV载体以高浓度(例如，至少以1E+12，5E+12，1E+13或5E+13vg/ml)产生，这适用于需要rAAV载体的高滴度和/或小给药量(例如注射或输注)的临床应用。在另外的实施方案中，本专利技术提供以下单独的或彼此任意组合实施方案、或与本文公开的其他实施方案的任何组合中的一种或多种：(1)用于制造rAAV载体的高度可靠/一致的UF/DF过程，其可根据操作变化降低制造风险；(2)从UF/DF过程中进行有效的rAAV载体回收，从而提供rAAV载体产量的总体增加(例如，从开始到结束的70％或更高的产量)；(3)避免显著的rAAV载体丢失；(4)减少、最小化或防止rAAV载体聚集(例如，通过诸如尺寸排阻色谱和/或动态光散射之类的技术无法检测到rAAV载体聚集)；(5)允许将rAAV载体浓缩至高浓度，例如5E+13vg/ml，同时减少、最小化或很少或不能检测到rAAV载体聚集(通过诸如尺寸排阻色谱和/或动态光散射的技术)；和/或(6)提供高效价的rAAV载体制备物，以在临床应用中实现小体积给药。附图说明图1显示了在TFF过程中剪切速率的增加如何显著改善rAAV载体回收率。首先使用渗滤缓冲液将CsCl超速离心后的AAV2-hTPP1v1载体(2.5E+14vg)稀释至50mL(5.0E+12vg/mL)。对于一个渗滤循环，将25mL渗滤缓冲液加入到50mL稀释的载体中，然后开始渗滤直至体积减少至50mL。渗滤步骤重复24次。在25个循环的渗滤过程后，将载体超滤至5mL。收集5mL载体用于测定。(A)qPCR分析显示，当在TFF过程中使用较高的剪切速率(约10,000秒-1(sec-1))时，载体滴度为4.81E+13vg/mL，这表明载体回收率超过90％；在低剪切速率(约3000sec-1)下达到1.38E+13vg/mL，这表示约30％的载体回收率。(B)动态光散射(DLS)分析表明，来自较高剪切速率(约10,000sec-1)或低剪切速率(约3000sec-1)的载体直径是相似的。图2显示了跨膜压(TMP)如何影响来自TFF过程的rAAV恢复。首先使用渗滤缓冲液将CsCl超速离心后的AAV2-hTPP1v1载体(2.5E+14vg)稀释至50mL(5.0E+12vg/mL)并开始DF过程，对于每个渗滤循环，添加25mL渗滤缓冲液至50mL稀释的载体，并将体积减少至50ml。渗滤步骤进行25次以实现充分的缓冲液交换。然后将载体超滤至5mL。Q-PCR分析(A)显示，当使用TMP(约10.5psig)时，载体滴度为3.43E+13vg/mL，并且在较高TMP(约15.5psig)下滴度为2.90E+13vg/mL。DLS分析显示，对于低TMP(约10psig)和相对高的TMP(约15.5psig)，载体制备物的直径分别为29.07nm和38.2nm。较大直径代表制备物中更多聚集的rAAV载体。图3显示了指示在UF/DF过程后没有循环的载体的收集避免了载体制备中聚集的rAAV颗粒的回收的数据。使用渗滤缓冲液将CsCl超速离心后的AAV2-hTPP1v1载体(2.5E+14vg)稀释至50mL(5.0E+12vg/mL)并使其经历UF/DF过程。通过直接排出浓缩的载体(推出)或通过在几分钟的闭合循环(cyculation)(循环)后排出浓缩的载体，以低于UF/DF流速收集载体。Q-PCR分析(A)显示载体滴度与两种不同的载体回收方法相似。然而，DLS分析(B)显示，在循环制备中载体的直径显著更大，这表明更多聚集的rAAV载体。图4显示了指示稀释低滴度载体(约5E+12vg/mL)通过UF/DF过程显著减少载体聚集的数据。将CsCl超速离心后的AAV2-hTPP1v1载体(2.5E+14vg)直接渗滤或首先使用渗滤缓冲液稀释，然后渗滤25个循环。在渗滤过程之后，将两种渗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)收获包含rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液；(b)任选地通过切向流过滤任选地浓缩在步骤(a)中收获的所述细胞和/或所述细胞培养物上清液，以产生浓缩的收获物；(c)任选地通过微流化裂解在步骤(a)中产生的所述收获物或在步骤(b)中产生的所述浓缩收获物以产生裂解物；(d)过滤步骤(c)中产生的所述裂解物以产生澄清的裂解物；(e)将步骤(d)中产生的所述澄清的裂解物进行离子交换柱层析，以产生包含纯化的rAAV载体颗粒的柱洗脱液，并任选通过切向流过滤浓缩所述柱洗脱液，以产生浓缩的柱洗脱液；(f)将在步骤(e)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液与氯化铯混合以产生混合物，并使所述混合物进行梯度超速离心以基本上从空衣壳AAV颗粒和其他AAV载体相关杂质分离出真正的rAAV载体颗粒；(g)(1)收集在步骤(f)中分离的所述真正的rAAV载体颗粒，以及(g)(2)在具有非离子表面活性剂的缓冲液中配制所收集的所述真正的rAAV载体颗粒；(h)将步骤(g)(2)中的所述真正的rAAV载体颗粒通过切向流过滤进行缓冲液交换以产生AAV载体制剂；以及(i)过滤步骤(h)中产生的所述AAV载体制剂，从而以高回收率或高滴度产生真正的rAAV载体颗粒制剂。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.21 US 62/365,3121.一种以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)收获包含rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液；(b)任选地通过切向流过滤任选地浓缩在步骤(a)中收获的所述细胞和/或所述细胞培养物上清液，以产生浓缩的收获物；(c)任选地通过微流化裂解在步骤(a)中产生的所述收获物或在步骤(b)中产生的所述浓缩收获物以产生裂解物；(d)过滤步骤(c)中产生的所述裂解物以产生澄清的裂解物；(e)将步骤(d)中产生的所述澄清的裂解物进行离子交换柱层析，以产生包含纯化的rAAV载体颗粒的柱洗脱液，并任选通过切向流过滤浓缩所述柱洗脱液，以产生浓缩的柱洗脱液；(f)将在步骤(e)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液与氯化铯混合以产生混合物，并使所述混合物进行梯度超速离心以基本上从空衣壳AAV颗粒和其他AAV载体相关杂质分离出真正的rAAV载体颗粒；(g)(1)收集在步骤(f)中分离的所述真正的rAAV载体颗粒，以及(g)(2)在具有非离子表面活性剂的缓冲液中配制所收集的所述真正的rAAV载体颗粒；(h)将步骤(g)(2)中的所述真正的rAAV载体颗粒通过切向流过滤进行缓冲液交换以产生AAV载体制剂；以及(i)过滤步骤(h)中产生的所述AAV载体制剂，从而以高回收率或高滴度产生真正的rAAV载体颗粒制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(1)的所述缓冲剂包含氯化钠和/或磷酸钠。3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(1)的所述缓冲液包含浓度为约10mM至浓度为约500mM的氯化钠。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(1)的所述缓冲液包含浓度为约5mM至浓度为约50mM的磷酸钠。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括聚亚烷基二醇。6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含至少一个聚乙二醇嵌段和至少一个聚丙二醇嵌段。7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括烷基多糖苷，十六十八醇，十六醇，椰油酰胺DEA，椰油酰胺MEA，癸基葡糖苷，乙氧基化物，IGEPALCA-630，Isoceteth-20，葡萄糖苷，麦芽糖苷，甘油一月桂酸酯，乙基苯基聚乙二醇(nonidetP-40)，壬基酚聚醚(nonoxynols)，如壬基酚聚醚-9，NP-40，八乙二醇单十二烷基醚，N-辛基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷，辛基葡糖苷，油醇，PEG-10向日葵甘油酯，五乙二醇单十二烷基醚，泊洛沙姆，如泊洛沙姆407，泊洛沙姆188(聚(环氧乙烷-共-聚环氧丙烷))，聚甘油聚蓖麻油酸酯，脱水山梨糖醇，硬脂醇，TritonX-100和吐温80。8.根据权利要求7的方法，其中所述乙氧基化物包括乙氧基化脂肪酸、醇乙氧基化物、三苯乙烯基苯酚乙氧基化物或乙氧基化脱水山梨糖醇脂肪酸酯。9.根据权利要求7的方法，其中所述脱水山梨糖醇包括脱水山梨糖醇单硬脂酸酯或脱水山梨糖醇三硬脂酸酯。10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括西土马哥(cetomacrogol1000)，聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)，聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)，聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)，聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)；聚甘油聚蓖麻油酸酯，十八烷酸[2-[(2R,3S,4R)-3,4-二羟基-2-四氢呋喃基]-2-羟乙基]酯，十八烷酸[(2R,3S,4R)-2-[1,2-双(1-氧代十八烷氧基)乙基]-4-羟基-3-四氢呋喃基]酯；C8至C22长链醇，如1-十八烷醇，十六烷硬脂醇，十六烷-1-醇和顺式-9-十八烯-1-醇；经取代或未经取代的辛基酚，其中取代基能包括聚乙氧基乙醇基团(例如，以形成辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)或将与辛基酚形成非离子表面活性剂的任何其它取代基；聚乙二醇单异十六烷基醚；十二烷酸2,3-二羟丙基酯；葡糖苷能包括月桂基葡糖苷，辛基葡糖苷和癸基葡糖苷；脂肪酸酰胺，如椰油酰胺二乙醇胺和椰油酰胺单乙醇胺；以及具有亲水性聚环氧乙烷链和芳香烃亲油或亲水基团的非离子表面活性剂，如壬基酚聚醚-9和TritonX-100。11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇或由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链组成的三嵌段共聚物，该中心链侧接两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇或三嵌段共聚物包含SYNPERONICF108(Aldrich)。13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂具有约0.0001％的浓度至约0.1％的浓度。14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂具有约0.0001％的浓度至约0.01％的浓度。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述真正的rAAV载体颗粒以约1015个颗粒/mL的浓度至约1018个真正的rAAV载体颗粒/mL的浓度存在于步骤(i)中产生的所述制剂中。16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的产率为至少约5×1012个真正的rAAV载体颗粒/ml。17.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的产率为至少约1×1013个真正的rAAV载体颗粒/ml。18.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的产率为至少约5×1013个真正的rAAV载体颗粒/ml。19.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的回收率是步骤(a)的总rAAV载体颗粒的至少约60％。20.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中所述真正的rAAV载体颗粒的回收率是步骤(a)的总rAAV载体颗粒的至少约70％。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述真正的rAAV载体颗粒衍生自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AA...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲光，约翰·弗雷泽·莱特，吴永勋，王玉环，张海波，劳拉·邓肯，
申请(专利权)人：星火治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US