【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改进的细胞转染和/或rAAV载体生产的增强剂相关申请信息本申请要求于2017年6月7日提交的美国临时专利申请No.62/516,432和2017年7月12日提交的美国临时专利申请No.62/531,626的优先权。上述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图的全部内容通过引用并入本文。
本专利技术涉及用核酸(例如质粒)进行细胞转导(转染)的领域。更具体地，本专利技术提供了用于产生转导的(转染的)细胞的组合物和方法，所述细胞任选地产生腺相关病毒(rAAV)载体。引用在整个说明书中引用了多个出版物和专利文件，以描述本专利技术所涉及的现有技术。这些引用中的每一个都通过引用并入本文，如同在本文完整地阐述。
技术实现思路
本专利技术提供了用至少一种核酸序列转染细胞的组合物和方法。在一个实施方案中，转染组合物和方法包括：(a)使细胞与用包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液配制的至少一种核酸接触；(b)用所述核酸和聚乙烯亚胺(PEI)溶液温育或培养所述细胞；(c)在步骤(a)时或之后立即或在步骤(a)后最多但不到3小时加入增强剂以产生混合物；以及(d)温育步骤(c)的所述混合物，从而用所述核酸序列转染所述细胞。本专利技术还提供了制备产生重组病毒载体(如rAAV载体)的细胞的组合物和制备方法。在一个实施方案中，一种组合物或方法包括以下步骤：(a)提供组分(i)、(ii)和(iii)的PEI/质粒混合物，其中(i)是包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(ii)是包含...
【技术保护点】
1.一种用至少一种核酸序列转染细胞的方法，其包括：/n(a)使细胞与用包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液配制的至少一种核酸接触；/n(b)用所述核酸和聚乙烯亚胺(PEI)溶液温育或培养所述细胞；/n(c)在步骤(a)时或之后立即或在步骤(a)后最多但不到3小时加入增强剂以产生混合物；以及/n(d)温育步骤(c)的所述混合物，从而用所述核酸序列转染所述细胞。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170607 US 62/516,432;20170712 US 62/531,6261.一种用至少一种核酸序列转染细胞的方法，其包括：
(a)使细胞与用包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液配制的至少一种核酸接触；
(b)用所述核酸和聚乙烯亚胺(PEI)溶液温育或培养所述细胞；
(c)在步骤(a)时或之后立即或在步骤(a)后最多但不到3小时加入增强剂以产生混合物；以及
(d)温育步骤(c)的所述混合物，从而用所述核酸序列转染所述细胞。
2.一种用于制备产生重组腺相关病毒(rAAV)载体的细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)提供组分(i)、(ii)和(iii)的PEI/质粒混合物：
(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；
(ii)包含编码蛋白或被转录成目标转录物的转基因的质粒；以及
(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，
(b)使细胞与步骤(a)的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；
(c)向所述质粒/PEI细胞培养物中添加增强剂以产生第二混合物；以及
(d)温育步骤(c)的所述第二混合物，从而制备产生重组rAAV载体的转染细胞。
3.一种用于制备产生重组腺相关病毒(rAAV)载体的细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)提供组分(i)、(ii)和(iii)的PEI/质粒混合物：
(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；
(ii)包含编码蛋白或被转录成目标转录物的转基因的质粒；以及
(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，
(b)使细胞与步骤(a)的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；
(c)向所述质粒/PEI细胞培养物中添加丙戊酸、其盐或其衍生物以产生第二混合物；以及
(d)温育步骤(c)的所述第二混合物，从而制备产生重组rAAV载体的转染细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其进一步包括步骤(e)收获在步骤(d)中产生的所述转染细胞和/或来自步骤(d)中产生的所述转染细胞的培养基，以产生细胞和/或培养基收获物。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其进一步包括步骤(e)培养、扩增、分离或选择已被所述核酸或质粒转染的细胞。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其进一步包括步骤(e)从步骤(d)产生的所述转染细胞分离和/或纯化重组AAV载体和/或从步骤(d)产生的所述转染细胞分离和/或纯化培养基。
7.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括步骤(f)从步骤(e)中产生的所述转染细胞和/或培养基收获物中分离和/或纯化重组AAV载体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸序列包括载体和/或质粒。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酸序列包含病毒载体和/或病毒质粒。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒载体或病毒质粒包括慢病毒载体或质粒、或腺相关病毒(AAV)载体或质粒。
11.根据权利要求8-9中任一项所述的方法，其中所述载体包括编码蛋白或被转录成目标转录物的转基因。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述转基因编码野生型或功能性变异凝血因子、apoE2、TPP1、精氨琥珀酸合酶、铜转运ATP酶2、酸性α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶或C1抑制剂丝氨酸蛋白酶抑制剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述野生型或功能性变异凝血因子为因子VII、因子VIII或因子IX。
14.根据权利要求1、2和4-13中任一项所述的方法，其中所述增强剂是丙戊酸、其盐或衍生物。
15.根据权利要求1、2和4-14中任一项所述的方法，其中所述增强剂在步骤(a)之前、在步骤(a)时或在步骤(a)之后立即或在步骤(a)之后最多但不到3小时添加。
16.根据权利要求1、2和4-15中任一项所述的方法，其中在步骤(a)或(b)之后将所述增强剂添加两次或更多次。
17.根据权利要求15所述的方法，其中首先在步骤(a)时或之后立即或在步骤(a)后最多但不到3小时首先添加所述增强剂，并在步骤(a)或(b)后12-72小时再次添加，或在步骤(a)或(b)后12-48小时再次添加，或在步骤(a)或(b)之后12-24小时再次添加。
18.根据权利要求2-17中任一项所述的方法，其中所述质粒(i)和(ii)的摩尔比范围为约1：0.01至约1：100，或摩尔比范围为约100：1至约1：0.01，其中所述组分(i)、(ii)和(iii)的混合物任选在步骤(b)之前温育约10秒至约4小时的时间段。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述核酸或质粒是在重量比范围为约0.1：1至约5：1的PEI：核酸或PEI：质粒，或重量比范围为约5∶1至约0.1∶1的PEI：核酸或PEI∶质粒中。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述核酸或质粒是在重量比范围为约1：1至约5：1的PEI：核酸或PEI：质粒，或重量比范围为约5∶1至约1∶1的PEI：核酸或PEI：质粒中。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(a)或(b)之前、之时或之后，或在步骤(c)之前或之时或之后，向所述细胞添加游离PEI。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(a)或(b)时或之后，或在步骤(c)时或之后，向所述细胞添加游离PEI。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，添加所述游离PEI，以使PEI：核酸或PEI：质粒的重量比在约0.1：1至约5：1的范围内，或在约5：1至约0.1：1的范围内。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，添加所述游离PEI，以使所述PEI：核酸或PEI：质粒的重量比在约1：1至约5：1的范围内，或在约5：1到约1：1的范围内。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述PEI：核酸和/或PEI：质粒中的所述PEI和/或游离PEI包括线性聚乙烯亚胺。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述PEI：核酸和/或PEI：质粒中的所述PEI和/或游离PEI包括水解的线性聚乙烯亚胺。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述PEI：核酸和/或PEI：质粒中的所述PEI和/或游离PEI包括游离碱形式的分子量为约4,000至约160,000和/或分子量为约2,500至约250,000的水解的线性聚乙烯亚胺。
28.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述PEI：核酸和/或PEI：质粒中的所述PEI和/或游离PEI包括游离碱形式的分子量为约40,000和/或分子量约25,000的水解的线性聚乙烯亚胺。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述核酸：PEI和/或质粒：PEI中，总PEI中的氮(N)比磷酸盐(P)的摩尔比在约1：1至约50：1(N：P)的范围内。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中在核酸：PEI和/或质粒：PEI中，总PEI中的氮(N)比磷酸盐(P)的摩尔比为约5：1至约10：1。
31.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中在核酸：PEI和/或质粒：PEI中，总PEI中的氮(N)比磷酸盐(P)的摩尔比为约5：1、6：1、7：1、8：1、9：1或10：1(N：P)中的任一种。
32.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中，所述游离PEI的量为所述总PEI的约10％至约90％。
33.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中，所述游离PEI的量为所述总PEI的约25％至约75％。
34.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中，所述游离PEI的量为所述总PEI的约50％。
35.根据权利要求21至34中任一项所述的方法，其中，所述游离PEI的量为约0.1μg/mL至约10μg/mL。
36.根据权利要求20至33中任一项所述的方法，其中，所述游离PEI的量为约1.0μg/mL至约5μg/mL。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中，所述PEI溶液和/或游离PEI包括pH为约7.0至约8.0的溶液。
38.根据权利要求1和3至36中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，将所述核酸序列和PEI彼此温育约10秒至约4小时。
39.根据权利要求1和4至37中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，将所述核酸序列和PEI彼此温育约30秒至约4小时。
40.根据权利要求1和4至37中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，将所述核酸序列和PEI彼此温育约1分钟至约30分钟。
41.根据权利要求3至40中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前，将所述组分(i)、(ii)和(iii)的混合物一起温育约10秒至约4小时。
42.根据权利要求3至40中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前，将所述组分(i)，(ii)和(iii)的混合物一起温育约30秒至约4小时。
43.根据权利要求3至40中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前，将所述组分(i)、(ii)和(iii)的混合物一起温育约1分钟至约4小时。
44.根据权利要求3至43中任一项所述的方法，其中所述步骤(d)的温育持续至少约4小时。
45.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述步骤(d)的温育持续约4小时至约140小时。
46.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述步骤(d)的温育持续约4小时至约96小时。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述细胞包括哺乳动物细胞。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述细胞是人胚肾(HEK)或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
49.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括人胚胎肾(HEK)293细胞。
50.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：曲光，陆林，耶苏萨·约苏阿姆韦斯特，约翰·弗雷泽·莱特，
申请(专利权)人：星火治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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