一种红豆杉悬浮细胞包埋玻璃化超低温保存方法技术

本发明专利技术公开了一种红豆杉悬浮细胞包埋玻璃化超低温保存方法。包括：(1)红豆杉愈伤组织的悬浮培养：挑取培养15d的白色或者淡黄色的愈伤组织，使用改良的MS-I号培养基；(2)红豆杉细胞系悬浮预培养：使用改良的MS-II号培养基预培养1天；(3)包埋；(4)预处理：用预装载液LB7处理胶球30～60分钟；(5)装载：用PVS3对胶球处理30～60分钟；(6)冷冻保存；(7)解冻：用45℃恒温水浴1分钟左右化冻；(8)恢复培养，在6周左右可以恢复生长。本发明专利技术方法操作简单易行，且恢复生长时间短，适合大规模的红豆杉种质资源的保存，方法适合多种红豆杉细胞系的保存，具有广谱的适应性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种红豆杉悬浮细胞包埋玻璃化超低温保存方法，属于红豆杉种子资源保存

技术介绍
红豆杉属(Taxus)红豆杉科(Taxaceae)常绿乔木，在我国主要分布有中国红豆杉(Taxuschinensis)、南方红豆杉(T.chinensisvar.mairei)、东北红豆杉(T.cuspidata)、云南红豆杉(T.yunnanensis)和西藏红豆杉(T.wallichinana)(张宗勤，刘志明.红豆杉.西北农林科技大学出版社，2010,10:1)。红豆杉属植物中含有二萜、三萜、甾体、高萜类化合物、黄酮类化合物、苯丙素类化合物等活性成分，其中萜类化合物目前已经超过560多种(祖元刚.南方红豆杉可再生资源高效加工利用技术.科学出版社，2010.2：13)，最为著名是异戊烯二萜中的紫杉醇在治疗癌症中具有显著的效果，其中Taxol为美国BMS公司注册商品医用专利药品(SoniaMaliketal.ProductionoftheanticancerdrugtaxolinTaxusbaccatasuspensioncultures:Areview.ProcessBiochemistry,2011(46):23-34)。紫杉醇用于治疗癌症始于1979年发现其在细胞有丝分裂过程促使细胞停滞于G2/M期(SchiffPB,HorwitzSB.Taxiolstabilizesmicrotubulesinmousefibroblastcells.ProcNatlAcadSciUSA,1980,77:1S61-65)，现已广泛了的应用于乳腺癌、肺癌、小细胞癌等，每千克紫杉醇的市场价格一度达到600000美元/千克(Smetanskal.Productionofsecondarymetabolitesusingplantcellcultrues.FoodBiotechnol,2008,111:187-228)。紫杉醇作为一种成功的抗癌药物其每年的市值已经超过1亿美元(MalikS,etal.ProductionoftheanticancerdrugtaxolinTaxusbaccatasuspensioncultures:Areview.ProcessBiochemistry,2011(46):23-34)，巨大的市场供需矛盾导致红豆杉属植物资源被掠夺性的开采，其已濒临灭绝，我国于1999年8月将红豆杉列入国家一级濒危保护植物(史清文，等.红豆杉属植物的化学研究-紫杉烷类化合物的研究.化学工业出版社，2013,1:1)。紫杉醇最初从树皮中提取，但其含量极低，且红豆杉属植物生长及其缓慢，以及提取工艺复杂和破坏环境等而受到限制。后来发展了化学合成法、半合成法、异源表达系统和细胞悬浮培养等途径，其中细胞悬浮培养因具有其生物产量不受地理位置和季节的限制、可以连续一致的生产目标化合物、将其转化为可再生资源以及获取的环境友好等优势，且极易实现工厂化的生产(SusanHowat,etal.Paclitaxel:biosynthesis,productionandfutureprospects.NewBiotechnology,2014,3(31):242-245)。红豆杉细胞悬浮培养在大规模发酵培养过程中也受限制于遗传不稳定性、培养过程中的异质化、相对于真菌培养生长缓慢、目标产物含量不稳定等因素的限制(KoleweME,etal.Pharmaceuticallyactivenaturalproductsynthesisandsupplyviaplantcellculturetechnology.MolPharm,2008,5:243-256)。因此筛选高产紫杉醇的细胞系和减少核心种质资源的多次继代培养等以减少遗传变异和污染是红豆杉细胞悬浮培养的重要环节之一。植物种质资源的保存主要包括种群原生地保存、室外离体保存和离体培养慢生长保存等方法，不同的植物种类和保存材料类型均有不同的保存方法。在所有的保存方法中，超低温保存能够应用于依靠无性繁殖方法的生物种质资源保存。不同的植物细胞、组织和器官包括悬浮细胞、花粉、胚状体培养物、体细胞胚胎、合子胚和茎尖等均可作为外植体用于超低温保存(M.E.González-Benito,etal.Review.Theuseofcryopreservationforgermplasmconservationofvegetativelypropagatedcrops.SpanishJournalofAgricultureResearch,2004,2(3):341-351)。大多数的活细胞含有较高的含水量，对0℃低温极度的敏感，利用冷冻保护剂结合缓慢降温的方法可以保存较大结构的如茎尖材料。最近几十年又新发展了玻璃化超低温保存法、包埋脱水干燥超低温保存法、微滴保存法。KimSI等成功的报道了利用程序降温的方法获得了悬浮培养7天的中国红豆杉超低温保存的方法(KimSI,etal.CryopreservationofTaxuschinensissuspensioncellcultures.Cryoletters,2000,22(1):43-50)。叶芳等采用程序降温的方法研究中国红豆杉超低保存法，得到红豆杉悬浮细胞TTC活力相对值为4.33％(叶芳，等.红豆杉愈伤组织超低温保存有关因素的研究.武汉植物学研究，2001,19(4)：327-331)。藏新等对悬浮培养16天的中国红豆杉细胞悬浮系采用程序降温的方法，成功的对细胞恢复性生长进行了验证(藏新，等.中国红豆杉悬浮培养细胞的超低温保存.生物技术，2002,2(12)：13-14)。K等利用简化的程控降温盒结合冷冻保存法保存了曼地亚红豆杉(Taxus×mediaRehd)和佛罗里达红豆杉(TaxusfloridanaNutt)细胞悬浮系，悬浮细胞成活率高低与细胞系有显著的关系(K,etal.CryopreservationofcellsuspensionculturesofTaxus×mediaandTaxusfloridana.BiologiaPlantarum,2008,52(2):329-333)。吴文娟建立了中国红豆杉和曼地亚红豆杉的玻璃化法超低温保存法、预培养干燥超低温保存法和干燥/玻璃化超低温保存法，但细胞悬浮系成活率偏低(吴文娟.红豆杉细胞系种质保存及遗传变异研究.华中科技大学,2009)。已有的研究均存在显著的不足，如需要利用昂贵的程控降温仪或者其他类似设备以及细胞基因型依赖性和成活率偏低等特点。包埋玻璃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红豆杉悬浮细胞包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)红豆杉愈伤组织的悬浮培养：挑取红豆杉愈伤组织接种于改良的MS‑I液体培养基中进行悬浮培养，改良的MS‑I液体培养基为：2500mg/L KNO3，2500mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2‑EDTA，27.8mg/L FeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L，Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，1～3mg/Lpicloram，0.5～1mg/L 6‑BA，用蒸馏水定容到1L，pH值为5.8；(2)红豆杉细胞系悬浮预培养：取步骤(1)中得到的分散良好的红豆杉悬浮细胞接种于改良的MS‑II液体培养基中悬浮培养；改良MS‑II液体培养基为：1000mg/L KNO3，500mg/L KCl，800mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2‑EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L，Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，60g/L D‑山梨醇，1～3mg/Lpicloram，0.5～1mg/L 6‑BA，用蒸馏水定容到1L，pH值为5.8；(3)包埋：将步骤(2)中的红豆杉细胞与海藻酸钠包埋液混合，滴入Ca2+溶液中形成包含红豆杉细胞的胶球；(4)预处理：将步骤(3)得到的包含红豆杉细胞的固定化胶球在预装载液中预处理；(5)装载：取步骤(4)预处理后的胶球使用装载液进行玻璃化处理；(6)冷冻保存：取步骤(5)中玻璃化处理后的胶球，更换4℃储藏的相同玻璃化液后连同冻存管一并立即放入液氮中保存。...

【技术特征摘要】
1.一种红豆杉悬浮细胞包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括以下步
骤：
(1)红豆杉愈伤组织的悬浮培养：挑取红豆杉愈伤组织接种于改良的MS-I液
体培养基中进行悬浮培养，改良的MS-I液体培养基为：2500mg/LKNO3，2500
mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，
37.3mg/LNa2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，
0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/LKI，6.2mg/L
H3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L，
Na2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，30g/L
蔗糖，1～3mg/Lpicloram，0.5～1mg/L6-BA，用蒸馏水定容到1L，pH值为5.8；
(2)红豆杉细胞系悬浮预培养：取步骤(1)中得到的分散良好的红豆杉悬浮细
胞接种于改良的MS-II液体培养基中悬浮培养；改良MS-II液体培养基为：1000
mg/LKNO3，500mg/LKCl，800mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/L
MgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，37.3mg/LNa2-EDTA，27.8mg/L
FeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐
酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，
8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/L，Na2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，
0.025mg/LCoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，60g/LD-山梨醇，1～3mg/Lpicloram，
0.5～1mg/L6-BA，用蒸馏水定容到1L，pH值为5.8；
(3)包埋：将步骤(2)中的红豆杉细胞与海藻酸钠包埋液混合，滴入Ca2+溶液
中形成包含红豆杉细胞的胶球；
(4)预处理：将步骤(3)得到的包含红豆杉细胞的固定化胶球在预装载液中预
处理；
(5)装载：取步骤(4)预处理后的胶球使用装载液进行玻璃化处理；
(6)冷冻保存：取步骤(5)中玻璃化处理后的胶球，更换4℃储藏的相同玻璃
化液后连同冻存管一并立即放入液氮中保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)挑取在固体培养基上继

\t代培养15天后的红豆杉愈伤组织接种，在22-25℃条件下100-120转/分钟恒温
摇床中进行悬浮培养，愈伤组织接种量为培养基重量的5-10％；每7-10天继代
培养1次；初代培养15-20天后用于步骤(2)的接种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中取步骤(1)中
得到的分散良好的红豆杉悬浮细胞接种于改良的MS-II液体培养基中悬浮培养1
天，培养条件为22-25℃，100-120转/分钟恒温摇床培养，接种量为抽滤步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊兴耀，李炎林，苏小军，张家银，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43