密码子优化的酸性α-葡萄糖苷酶表达盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供了编码酸性α

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】密码子优化的酸性
α-葡萄糖苷酶表达盒及其使用方法
相关申请
[0001]本申请要求于2018年5月16日提交的美国临时专利申请No.62/672,419和于2018年9月21日提交的美国临时专利申请No.62/734,454的优先权。前述专利申请的包括所有文本、表格、序列表和附图的全部内容通过引用方式并入本文。

技术介绍

[0002]II型糖原贮积病，也称为庞贝氏病，是一种常染色体隐性遗传疾病，其由编码溶酶体酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的基因突变引起，该酶催化糖原降解。所产生的酶缺乏导致人体所有组织中糖原的病理性积累和溶酶体改变，从而导致心脏、呼吸和骨骼肌功能障碍(van der Ploeg&Reuser,2008 Lancet,372:1342-1353)。传统上，庞贝氏病已分为两种主要的表型-婴儿发作性庞贝氏病(IOPD)(也称为婴儿型庞贝氏病(IPD)或早发型庞贝氏病)和晚发型庞贝氏病(LOPD)
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基于残留的GAA酶活性，发病年龄，器官受累(即存在心肌病)，严重程度和进展速度。庞贝氏病可使用酶替代疗法(ERT)；然而，它有一些局限性(即有限的生物分布和高免疫原性)，导致治疗失败和长期疗效有限(van der Ploeg&Reuser,2008)。

技术实现思路

[0003]本文公开了用于肝脏定向表达人GAA的可分泌形式的优化的盒。对盒的这些优化导致肝脏中GAA分泌的增加，并使肝脏基因转移达到GAA的循环水平，足以在受试者中系统交叉纠正GAA缺乏症。这些盒可提高转基因表达，改善安全性并可能降低免疫原性。这些盒将用作庞贝氏病和其他可通过GAA治疗的疾病和障碍的受试者的基因疗法。
[0004]进行GAA表达盒的密码子优化以改善GAA的表达。在一实施方案中，修饰编码GAA的核酸序列以消除CpG二核苷酸。总共创建了20个新的密码子优化的转基因序列(GAA1-GAA20)。基于GAA活性的体外比较，选择了5个密码子优化的序列(GAA 2、5、7、8和13)用于进一步优化。在将29个碱基对的多核苷酸序列添加到5'非翻译区(UTR)后，GAA13序列用于分析GAA表达的差异。还针对GAA7、8和13对来源于牛生长激素(bGH或BGH)的两种不同的聚腺苷酸化序列(野生型和CpG减少型)进行了评估。将所得到的9个表达盒(表1)包装在SEQ ID NO：30-32衣壳中；一个也被包装到AAV6衣壳中。
[0005]根据本专利技术，提供了编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的核酸，包含编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的核酸的表达盒，和包含编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的核酸的病毒载体。
[0006]在一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-5所示的任何序列具有大于86％的序列同一性。在另外的方面，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-5所示的任何序列具有大于87％的序列同一性。
[0007]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：6-15所示的任何序列具有大于87％的序列同一性。在特定方面，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：6-15所示的任何序列具有大于88％的序列同一性。在另外的特定方面，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：6-15所示的任何序列具有大于89％的序列同一性。在另外的特定方面，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：
6-15所示的任何序列具有大于90％的序列同一性。在另外的特定方面，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：6-15所示的任何序列具有大于91％的序列同一性。
[0008]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：16-24所示的任何序列具有大于91％的序列同一性。
[0009]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有大于92％的序列同一性。
[0010]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有大于93％的序列同一性。
[0011]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有大于94％的序列同一性。
[0012]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有大于95％的序列同一性。
[0013]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有大于96％的序列同一性。
[0014]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有大于97％的序列同一性。
[0015]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有大于98％的序列同一性。
[0016]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有大于99％的序列同一性。
[0017]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有大于99.5％的序列同一性。
[0018]在另一实施方案中，编码GAA的核酸与如SEQ ID NO：1-24所示的任何序列具有100％的序列同一性。
[0019]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含少于127个CpG二核苷酸。
[0020]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含少于126个CpG二核苷酸。
[0021]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约126-120个CpG二核苷酸。
[0022]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约120-110个CpG二核苷酸。
[0023]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约110-100个CpG二核苷酸。
[0024]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约100-90个CpG二核苷酸。
[0025]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约90-80个CpG二核苷酸。
[0026]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约80-70个CpG二核苷酸。
[0027]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约70-60个CpG二核苷酸。
[0028]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约60-50个CpG二核苷酸。
[0029]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约50-40个CpG二核苷酸。
[0030]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约40-30个CpG二核苷酸。
[0031]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约30-20个CpG二核苷酸。
[0032]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含少于20个CpG二核苷酸。
[0033]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含约20-10个CpG二核苷酸。
[0034]在另一实施方案中，编码GAA的核酸包含少于10个CpG二核苷酸。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.编码酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的核酸，其中所述核酸与选自由如SEQ ID NO：1-5所示的任何序列组成的组的序列具有大于86％的序列同一性。2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述核酸与选自由如SEQ ID NO：1-5所示的任何序列组成的组的序列具有大于87％的序列同一性。3.编码GAA的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于87％的序列同一性。4.根据权利要求3所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于88％的序列同一性。5.根据权利要求3所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于89％的序列同一性。6.根据权利要求3所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于90％的序列同一性。7.根据权利要求3所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：6-15所示的任何序列组成的组的序列具有大于91％的序列同一性。8.编码GAA的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：16-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于91％的序列同一性。9.根据权利要求1-8中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含少于127个CpG二核苷酸。10.编码GAA的核酸，其中所述核酸包含少于127个CpG二核苷酸。11.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含少于126个CpG二核苷酸。12.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约126-120个CpG二核苷酸。13.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约120-110个CpG二核苷酸。14.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约110-100CpG二核苷酸。15.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约100-90个CpG二核苷酸。16.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约90-80个CpG二核苷酸。17.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约80-70个CpG二核苷酸。18.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约70-60个CpG二核苷酸。19.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约60-50个CpG二核苷酸。20.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约50-40个CpG二核苷酸。21.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约40-30CpG二核苷酸。
22.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约30-20个CpG二核苷酸。23.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含少于20个CpG二核苷酸。24.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中，所述核酸包含约20-10个CpG二核苷酸。25.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含少于10个CpG二核苷酸。26.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含约10-5个CpG二核苷酸。27.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含5个CpG二核苷酸。28.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含4个CpG二核苷酸。29.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含3个CpG二核苷酸。30.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含2个CpG二核苷酸。31.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含1个CpG二核苷酸。32.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含0个CpG二核苷酸。33.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于92％的序列同一性。34.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于93％的序列同一性。35.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于94％的序列同一性。36.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于95％的序列同一性。37.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于96％的序列同一性。38.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于97％的序列同一性。39.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于98％的序列同一性。40.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于99％的序列同一性。41.根据权利要求1-32中任一项所述的核酸，其中所述核酸与选自由SEQ ID NO：1-24所示的任何序列组成的组的序列具有大于99.5％的序列同一性。42.编码GAA的核酸，其选自由SEQ ID NO：1-24组成的组。43.表达盒，其包含与表达控制元件可操作连接的根据权利要求1-7和9-42中任一项所述的核酸。44.根据权利要求43所述的表达盒，其中所述表达控制元件位于所述核酸的5'末端。45.根据权利要求44所述的表达盒，其进一步包含位于所述核酸的3'末端的聚腺苷酸
化序列。46.根据权利要求44或45所述的表达盒，其中，与野生型表达控制元件或聚腺苷酸化序列相比，所述表达控制元件或聚腺苷酸化序列的CpG减少。47.根据权利要求43-46中任一项所述的表达盒，其中，所述表达控制元件包含ApoE/hAAT增强子/启动子序列。48.根据权利要求45-47中任一项所述的表达盒，其中，所述聚腺苷酸化序列包括牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化序列。49.根据权利要求47或48所述的表达盒，其中与野生型ApoE/hAAT增强子/启动子序列或bGH聚腺苷酸化序列相比，所述ApoE/hAAT增强子/启动子序列或bGH聚腺苷酸化序列的CpG减少。50.根据权利要求49所述的表达盒，其中所述野生型bGH聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO：27的序列。51.根据权利要求49所述的表达盒，其中所述野生型ApoE/hAAT增强子/启动子序列包含SEQ ID NO：28或29的序列。52.根据权利要求49所述的表达盒，其中所述CpG减少的bGH聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO：26的序列。53.根据权利要求43-52中任一项所述的表达盒，其进一步包括位于在所述表达控制元件的3'端与所述核酸的5'端之间的内含子。54.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：泽维尔，
申请(专利权)人：星火治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：