【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于重组蛋白和/或病毒载体生产的细胞系相关申请本申请要求于2016年3月30日提交的美国临时专利申请No.62/315,480的优先权。前述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图在内的全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
谷氨酰胺合成酶(GS)是合成氨基酸L-谷氨酰胺的酶。因此，GS阴性细胞系对L-谷氨酰胺是营养缺陷型。已经报道GS作为基于CHO细胞的重组蛋白表达系统中的选择标记基因(Wurmetal.(2004)NatureBiotechnology22:1393-1398)。当将盒引入GS阴性CHO系时，可以使用GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺选择含有GS基因的表达盒。二氢叶酸还原酶(DHFR，5,6,7,8-四氢叶酸：NADP+氧化还原酶)是真核生物和原核生物两者中的酶，并且催化将二氢叶酸还原为四氢叶酸的NADPH依赖性还原，四氢叶酸是在胸苷酸、嘌呤核苷酸、甘氨酸和甲基化合物的生物合成中的一碳单元的必需载体。DHFR缺陷细胞仅在补充有叶酸代谢中涉及的某些因子的培养基中生长，或者如果向细胞提供DHFR，则例如作为转基因。
技术实现思路
本文公开了能够产生治疗性蛋白、抗体、载体...
【技术保护点】
1.一种人胚胎肾(HEK)细胞，其不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)和/或谷氨酰胺合成酶(GS)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.30 US 62/315,4801.一种人胚胎肾(HEK)细胞，其不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)和/或谷氨酰胺合成酶(GS)。2.一种人胚胎肾(HEK)细胞系，其不表达功能性内源性二氢叶酸还原酶(DHFR)和/或谷氨酰胺合成酶(GS)。3.根据权利要求1或2所述的HEK细胞或细胞系，其用第一异源核酸序列稳定或瞬时转染，并任选地用第二异源核酸序列稳定或瞬时转染。4.根据权利要求1或2所述的HEK细胞或细胞系，其用第一异源核酸序列和第一选择标记稳定或瞬时转染，并任选地用第二异源核酸序列和第二选择标记稳定或瞬时转染。5.根据权利要求3或4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一异源核酸序列编码治疗性蛋白或多核苷酸序列，并且任选的第二异源核酸序列编码治疗性蛋白或多核苷酸序列。6.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中由所述第一异源核酸序列编码的所述治疗性蛋白或多核苷酸序列和由所述任选的第二异源核酸序列编码的所述治疗性蛋白或多核苷酸序列相同或不同。7.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二选择标记不提供对抗生素的抗性。8.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二选择标记提供扩增所述第一和/或第二异源核酸序列的手段。9.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二选择标记包含编码具有DHFR功能的蛋白的核酸。10.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二选择标记包含编码具有GS功能的蛋白的核酸。11.根据权利要求4所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一选择标记包含编码具有DHFR功能的蛋白的核酸，而所述第二选择标记包含编码具有GS功能的蛋白的核酸。12.根据权利要求3-11所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一异源核酸序列包含第一载体，并且所述任选的第二异源核酸序列包含第二载体。13.根据权利要求11或12所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一载体和任选的第二载体相同或不同。14.根据权利要求11或12所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一载体和任选的第二载体各自包含选择标记，所述选择标记包含编码具有DHFR功能的蛋白的核酸或编码具有GS功能的蛋白的核酸。15.根据权利要求12-14中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一载体包含第一病毒载体，而任选的第二载体包含第二病毒载体。16.根据权利要求12-14中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述第一或第二病毒载体包含AAV载体基因组。17.根据权利要求12-14中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其包含第一和第二病毒载体，其中所述病毒载体各自包含AAV载体基因组。18.根据权利要求17所述的HEK细胞或细胞系，其中所述AAV载体基因组包含位于所述异源核酸序列的5'和/或3'末端侧翼的一个或两个AAVITR。19.根据权利要求4-18中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中在所述HEK细胞或细胞系中的所述异源核酸序列和/或载体和/或病毒载体和/或AAV载体基因组的拷贝数为每个细胞1-5个拷贝，每个细胞5-10个拷贝，每个细胞10-50个拷贝，每个细胞50-100个拷贝，每个细胞100-250个拷贝，每个细胞250-500个拷贝，每个细胞500-1000个拷贝，每个细胞1000-2000个拷贝，或约2000、3000、4000或5000个拷贝，或大于每个细胞2000、3000、4000或5000个拷贝，并且任选地其中拷贝数在许多传代中表现稳定，例如，在至少或大于5、10、15或更多次传代中表现稳定。20.根据权利要求16-19中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中在所述HEK细胞或细胞系中的所述AAV载体基因组的拷贝数为每个细胞至少1000个拷贝，并且来自HEK细胞或HEK细胞系的滚瓶的所述rAAV载体颗粒产率任选为至少1×108vg/ml，或至少1×109vg/ml，或至少1×1010vg/ml，或至少1×1011vg/ml或至少2×1011vg/ml。21.根据权利要求1-20中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其进一步包含AAVrep和/或cap序列。22.根据权利要求20所述的HEK细胞或细胞系，其中所述AAVrep和/或cap序列由质粒提供，所述质粒瞬时或稳定地转染到所述HEK细胞或细胞系中。23.根据权利要求1-22中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其进一步包含AAV辅助功能序列。24.根据权利要求1-23中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述HEK细胞或细胞系是HEK293。25.根据权利要求1-24中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其在培养物或生长培养基中，或在适于长期储存的培养基中。26.根据权利要求9-25中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其在包含甲氨蝶呤(MTX)和/或甲硫氨酸磺胺(MSX)的培养基或生长物中。27.根据权利要求6-26中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述HEK细胞或细胞系产生rAAV载体颗粒，所述rAAV载体颗粒已将所述异源核酸序列包装在其内。28.根据权利要求27所述的HEK细胞或细胞系，其中所述rAAV载体颗粒以比表达功能性内源性DHFR和/或GS的HEK293细胞生产的量大的量生产并且用具有所述异源核酸序列的AAV载体基因组瞬时转染。29.根据权利要求27所述的HEK细胞或细胞系，其中与已经包装了由表达功能性内源DHFR和/或GS的HEK293细胞生产的污染DNA并且用具有所述异源核酸序列的rAAV载体基因组瞬时转染的AAV空衣壳和/或rAAV颗粒的量比，所生产的所述AAV载体颗粒含有已经包装污染DNA的较少量的rAAV空衣壳和/或较少量的rAAV颗粒。30.根据权利要求3-29中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其中所述异源核酸序列编码治疗性蛋白或抑制性核酸序列。31.根据权利要求30所述的HEK细胞或细胞系，其中所述治疗性蛋白包含凝血因子或免疫球蛋白序列。32.根据权利要求30所述的HEK细胞或细胞系，其中所述抑制性核酸序列包含小或短发夹(sh)RNA、微小RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA。33.根据权利要求3-32中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其用所述第一异源核酸序列稳定转染。34.根据权利要求3-32中任一项所述的HEK细胞或细胞系，其用所述第一和所述第二异源核酸序列稳定转染。35.从权利要求15-34中任一项所述的HEK细胞或细胞系分离或纯化的病毒或rAAV载体颗粒。36.从权利要求5-34中任一项所述的HEK细胞或细胞系分离或纯化的治疗性蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：周静敏，曲光，约翰·弗雷泽·莱特，
申请(专利权)人：星火治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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