一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法和应用；该细胞系名称为BHK-21CIAPIN1+，保藏编号为CCTCCC2014149，其表达CIAPIN1蛋白的量是正常BHK-21细胞的10倍；该细胞系的制备方法为将CIAPIN1的cDNA序列插入真核表达质粒pIRESneo中，再转染BHK-21细胞；经含G418培养液筛选后细胞经极限稀释法获得阳性单克隆细胞，即为永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。本发明专利技术细胞系培养狂犬病病毒可显著影响病毒增值滴度，对该病毒的高效培养及其灭活疫苗的生产意义重大，本发明专利技术细胞系在狂犬病病毒的培养中具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法和应用
本专利技术属于生物技术和细胞遗传学领域，涉及一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法和应用。
技术介绍
CIAPIN1(cytokineinducedapoptosisinhibitor1)又称anamorsin，是一个新近发现与凋亡相关的分子。CIAPIN1在人类基因定位于16号染色体长臂。由8个外显子和7个内含子组成，相对分子质量为39000。在其N端60-99氨基酸位点发现genericmethyltransferaseprofile结构域，C端部分序列与保守的基因COG5636同源，246-277氨基酸有Cx2Cx24Cx2C锌带结构域。CIAPIN1在小鼠基因定位于8号染色体，成熟mRNA长度为1515bp，CDS长度为929bp。Shibayama等2004年第一次报道了该分子为细胞因子诱导的抗凋亡分子。研究还表明CIAPIN1是RAS信号转导通路中的一个新调节分子，Ras信号途径是与许多细胞增殖有关的信号转导通路，该通路独立于凋亡调节分子caspase家族、Bcl-2家族等。Kanakura等发现CIAPIN1可调节造血功能，CIAPIN1基因在小鼠胚胎期IL-3诱导红系定向干细胞分化过程中起至关重要的作用，CIAPIN1基因敲除小鼠由于于贫血而于胚胎期死亡。新近研究在成功制备了CIAPIN1的单克隆抗体工作基础上，发现CIAPIN1广泛分布于胎儿和成人的正常组织中，特别是在分化型组织和活性代谢组织中具有高表达。Hao等确定了CIAPIN1的亚细胞定位为胞质、胞核，浓集于核仁。Li等通过腺病毒载体表达CIAPIN1蛋白，以及通过SiRNA等技术证明了，CIAPIN1蛋白的表达变化与肝细胞癌、胃癌密切相关。Hao等研究发现CIAPIN1蛋白与肾癌、胃癌相关。Wang等人发现，肺癌组织中CIAPIN1基因表达下调可能与肺癌发生密切相关，CIAPIN1基因可能通过下调CyclinD1、上调P27干预了细胞周期，从而抑制肿瘤的生长。上述研究结果揭示，CIAPIN1对细胞的增殖及分化具有重要的调控作用，在某些癌症发生时表达异常，提示CIAPIN1基因的表达与肿瘤的发生发展有密切联系。目前，关于CIAPIN1研究的报道还非常有限，主要集中在肿瘤相关性方面，然而这些结果业已证明CIAPIN1对细胞的增殖及分化具有重要的调控作用，在细胞凋亡与抗凋亡中发挥重要作用。在前期的研究中，我们也发现狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV）感染N2a细胞时可引起CIAPIN1蛋白上调表达，并且细胞适应性好的RV毒株感染时诱导的CIAPIN1蛋白上调表达量更高。这提示我们，不同细胞适应性的RV毒株，感染细胞时在细胞内增殖和代谢的速度不同，因而引起了不同的应答结果，导致CIAPIN1等蛋白的差异表达，这说明RV感染时CIAPIN1发挥着关键的调节作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。本专利技术的另一目的在于提供一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系的应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种过表达CIAPIN1蛋白细胞系的制备方法，包括以下步骤：1）构建重组真核表达质粒：RT-PCR扩增CIAPIN1蛋白的cDNA序列，并将其插入真核表达质粒pIRESneo中，获得重组真核表达质粒pIRES-CI；2）转染：将上述重组真核表达质粒转染BHK-21细胞；3）筛选：将转染后的细胞以含G418的培养液进筛选培养；4）获得永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系：将经筛选培养的细胞经极限稀释法获得阳性单克隆细胞，其中能过表达CIAPIN1蛋白的即为永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。进一步的，步骤1）中编码CIAPIN1蛋白的cDNA序列如SEQIDNO：1所示。进一步的，上述CIAPIN1蛋白cDNA的RT-PCR扩增引物为：CIAPIN1-F:GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC（SEQIDNO：2）；CIAPIN1-R:GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT（SEQIDNO：3）。进一步的，步骤2）中的转染为：用FuGENE转染试剂介导重组真核表达质粒pIRES-CI传染汇合度为70-80%的单层BHK-21细胞，转染后的细胞用含5~10%(v/v)小牛血清的DMEM培养基进行培养。进一步的，步骤3）中G418的浓度为500μg/ml。一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系，其名称为BHK-21CIAPIN1+，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCC2014149。进一步的，上述细胞系表达CIAPIN1蛋白的量是BHK-21细胞的8倍。本专利技术的有益效果是：1）本专利技术的细胞系可永久化的高量表达CIAPIN1蛋白，且易培养，增殖速度快，可无限扩大，性质稳定，易保存，方法技术成熟，重复性强，一般研究人员即可完成，具有遗传稳定性。2）本专利技术过表达CIAPIN1蛋白的细胞系及其制备方法具有深远的研究性和广泛的应用性，包括研究宿主细胞免疫反应具有稳定性以及可表达所需蛋白的哺乳动物细胞的永生化，以及细胞和CIAPIN1蛋白对狂犬病病毒增殖滴度的影响。3）在制备过表达CIAPIN1蛋白细胞系的具体操作中，细胞摄取、整合、表达外源基因往往都是小概率事件，只有在特定的操作条件下才能提高这些小概率事件的发生；另外，外源基因整合到基因组中的概率小，而且是随机整合到基因组中的，故转染后的不同细胞表达的目的蛋白的量存在很大差异，且随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少；本专利技术方法通过优化每一步的操作，明显提高了基因重组细胞系的发生率，可获得许多高表达CIAPIN1蛋白的细胞系；并且经过筛选和验证，本专利技术获得一株超高表达CIAPIN1蛋白的细胞系（表达量是BHK-21细胞的8倍），其分类命名为叙利亚仓鼠肾细胞系BHK-21CIAPIN1+，已于2014年7月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:C2014149，经过多代的代培养仍具有走超高效的过表达CIAPIN1蛋白能力，且稳定性很好，是一株永久化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。附图说明图1是G418压力筛选出的单克隆细胞株图；图2WesternBlot检测验证细胞系过表达CIAPIN1蛋白的情况。具体实施方式一种过表达CIAPIN1蛋白细胞系的制备方法，包括以下步骤：1）构建重组真核表达质粒：RT-PCR扩增CIAPIN1蛋白的cDNA序列，并将其插入真核表达质粒pIRESneo中，获得重组真核表达质粒pIRES-CI；2）转染：将上述重组真核表达质粒转染BHK-21细胞；3）筛选：将转染后的细胞以含G418的培养液进筛选培养；4）获得永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系：将经筛选培养的细胞经极限稀释法获得阳性单克隆细胞，其中能过表达CIAPIN1蛋白的即为永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。优选的，步骤1）中编码CIA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种过表达CIAPIN1蛋白细胞系的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）构建重组真核表达质粒：RT‑PCR扩增CIAPIN1蛋白的cDNA 序列，并将其插入真核表达质粒pIRESneo中，获得重组真核表达质粒pIRES‑CI；2）转染：将上述重组真核表达质粒转染BHK‑21细胞；3）筛选：将转染后的细胞以含G418 的培养液进筛选培养；4）获得永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系：将经筛选培养的细胞经极限稀释法获得阳性单克隆细胞，其中能过表达CIAPIN1蛋白的即为永生化过表达CIAPIN1蛋白的细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种过表达CIAPIN1蛋白的细胞系，其名称为BHK-21CIAPIN1+，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCC2014149。2.根据权利要求1所述的一种过...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓虎，向华，黄元，陈晶，陈远媚，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44