hTERT介导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建制造技术

本发明专利技术涉及用于医学领域的hTERT介导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建，其主要特征是以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo，以Ligation Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以纯化扩增并挑取耐氨苄青霉素菌落抽提质粒，以脂质体转染离体传代呈对数生长的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、免疫组化、细胞增殖周期及其凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT介导体外研究T淋巴细胞模型冻存于液氮，为从细胞水平在体外长期研究相关疾病的发病机制奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
hTERT介导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建
本专利技术涉及端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)介导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建，主要用于医学免疫学研究领域，为开展T淋巴细胞或与T淋巴细胞相关的各种研究提供细胞模型并保存其科研资源。
技术介绍
人类血液中的有形成份分为红细胞、白细胞和血小板。其中的白细胞以中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞为主。淋巴细胞又分为T淋巴细胞(T细胞)和B淋巴细胞(B细胞)等。 已知T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的-类细胞。按其功能可分为三个亚群:辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。T细胞是相当复杂的不均一体、又不断在体内更新、在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的亚群。按免疫应答中的功能不同，又可将T细胞分成若干亚群，一致公认的有:辅助性T细胞(Helper T cells, Th)，具有协助体液免疫和细胞免疫的功能；抑制性T细胞(Suppressor T cells, Ts)，具有抑制细胞免疫及体液免疫的功能；效应T细胞(Effector T eells, Te)，具有释放淋巴因子的功能；细胞毒T细胞(cytotoxic T cellS，Tc)，具有杀伤靶细胞的功能；迟发性变态反应T细胞(Td)，有参与IV型变态反应的作用；放大T细胞(Ta)，可作用于Th和Ts，有扩大免疫效果的作用；处女或天然T细胞(Virgin or Natural T cells),他们和抗原接触后分化成效应T细胞和记忆T细胞；记忆T细胞(Tm)，有记忆特异性抗原刺激的作用。 其中，Th细胞又被称为CD4+细胞，因为其在表面表达CD4(cluster ofdifferentiat1n^:)。通过与 MHC II (主要组织相容性复合体，major histocompatibilitycomplex)递呈的多肽抗原反应被激活。MHC II在抗原递呈细胞(antigen presentingcells,APCs)表面表达。一旦激活，可以分泌细胞因子，调节或者协助免疫反应。Tc细胞又名为⑶8+细胞，其表面表达⑶8.这类细胞可以通过MHCI与抗原直接结合。T淋巴细胞还可进一步分为辅助/诱导T淋巴细胞(⑶3+⑶4+)、抑制/细胞毒T淋巴细胞(⑶3+⑶8+)、CD4+T 细胞纯真亚群(CD4+CD45RA+/CD4+CD45RA+62L+)和记忆亚群(CD4+CD45RA-/CD4+CD45R0+)、功能亚群(CD28+)、激活亚群(CD38+、HLA-DR+)、凋亡亚群(CD95+)等。 T细胞是淋巴细胞的主要组分，T细胞的正常功能对人类抵御疾病非常重要。T细胞不产生抗体，其免疫应答是细胞免疫，如与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强；辅助或抑制B细胞产生抗体。在抵御疾病感染、肿瘤形成中起重要作用。而B细胞是通过产生抗体起作用。抗体存在于体液里，所以B细胞的免疫作用叫作体液免疫。 淋巴细胞的平均寿命一般为7天左右，不能在体外较长时间的传代培养。因为淋巴细胞在体外培养时易于在短时间内死亡，所以难以开展需在体外长期培养的淋巴细胞生物学功能的研究。为了解决这个问题，国内外文献报道用EB病毒转染法使B淋巴细胞永生化,建立B淋巴细胞系(株)，以满足上述科研的需要。建立这种永生B淋巴细胞系的原理基于B淋巴细胞表面有EB病毒的受体。而T淋巴细胞的表面没有EB病毒的受体，所以就无法用该方法来建立永生T淋巴细胞系。至今尚未见有关可在体外长期传代培养的T淋巴细胞系的建立方法。 国外文献报道，猴肾病毒40 (SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。 但最近有研究发现，SV40Tag转染的细胞伴随着DNA损伤修复机制的丢失、核型的不稳定性以及少数细胞致瘤性转化。此外，长期体外培养发现部分转染SV40Tag的细胞只是延长了寿命，或仅仅渡过了衰老期(MI期)，多数细胞会最终进入危机期(M2期)而死亡，说明细胞并未获得永生化。同时SV40病毒具有致瘤性，与某些肿瘤的发生、发展有关，因此SV40Tag转染的细胞对某些研究也存在一定程度的限制性。 国外研究表明，导入外源性hTERT可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对“正常”的生长特征。可以用于人类和动物某些种类的细胞模型的建立，对借助于研究转基因永生化细胞模型而研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制，具有重要的意义。 在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。 但是，至今尚未见有关以hTERT构建可用于在体外从细胞水平研究与T淋巴细胞相关疾病发病机制的永生T细胞模型及其细胞库的文献报道，也无法开展相关项目的研究。为了解决上述问题，本专利技术人提出了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供以hTERT介导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建方法，另一目的是为在体外从细胞水平研究T淋巴细胞相关疾病的发病机制提供hTERT介导T淋巴细胞模型及其细胞库。 本专利技术的目的是这样实现的:以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo,以Ligat1n Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入离体传代呈对数生长的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选的阳性重组子的克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT介导T淋巴细胞体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平在体外长期研究与T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于医学领域的hTERT介导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建，其主要特征是以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo‑hTERT和载体pLXSNneo，以Ligation Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo‑hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以纯化扩增并挑取耐氨苄青霉素菌落抽提质粒，以脂质体转染离体传代呈对数生长的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、免疫组化、细胞增殖周期及其凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT介导体外研究T淋巴细胞模型冻存于液氮，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究相关疾病的发病机制奠定基础。

【技术特征摘要】
1.一种用于医学领域的hTERT介导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建，其主要特征是以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo,以Ligat1n Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以纯化扩增并挑取耐氨苄青霉素菌落抽提质粒，以脂质体转染离体传代呈对数生长的T淋巴细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、免疫组化、细胞增殖周期及其凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT介导体外研究T淋巴细胞模型冻存于液氮，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究相关疾病的发病机制奠定基础。2.根据权利要求1所述的hTERT基因介导T淋巴细胞模型及其细胞库的构建，其特征是所指细胞模型为(I)T淋巴细胞转染了 hTERT基因而成为可长期传代培养的永生化T淋巴细胞模型；⑵T淋巴细胞模型的染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”;(3)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在h印ato ZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)因细胞的DNA中整合了 hTERT基因，所以表达hTERT基因的mRNA产物；(7)体外连续培养9-10周(第75代)仍处于对数生长期；(8)能反复冻存、长期传代培养；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，徐向荣，沈国松，李晓，严恺，黄荷凤，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33