本发明专利技术公开了一种携带前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其应用。该rAAV载体是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为PAP抗原基因得到。本发明专利技术的rAAV的病毒载体可将其携带的PAP抗原基因输送入单核细胞‑树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明专利技术的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在体外或患者体内可有效地抑制PAP抗原阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明专利技术的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗抗PAP抗原阳性的前列腺癌的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗PAP阳性的前列腺癌药物中的应用。
技术介绍
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(Samulski RJ,Srivastava A,Berns KI,Muzyczka N.Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids:gene correction within the terminal repeats of AAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因(Hermonat PL,Labow MA,Wright R,Berns KI,Muzyczka N.Genetics of adeno-associated virus:isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants.J Virol.51:329-339.Hermonat,P.L.,and Muzyczka,N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和rep基因之间的p5启动子(Labow MA,Hermonat PL,Berns KI.Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome.J Virol.160:251-258.)。1984年，美国Paul L.Hermonat证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病是帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型(AAV-I)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才
能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV可分为12种血清型(AAV-1～AAV-12)。其中，2型腺相关病毒载体(AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括Rep和Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)。如何构建可用于制备治疗疾病的药物的重组腺相关病毒及其相关产品是本领域技术人员努力的方向。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种稳定性高、携带前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体及其构建方法与应用。本专利技术的技术问题通过以下的技术方案予以解决：一种携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体，将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为PAP抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。已知的腺相关病毒载体具有p5启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将PAP抗原基因插入已经成功构建的启动子为巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子(β-actinp)、猴空泡病毒40(SV40)早期启动子(SV40p)中的一种的AAV载体中。本专利技术还提供携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入PAP抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。本专利技术所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将AAV载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因PAP与被切断的AAV载体DNA进行连接，得到携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体。该rAAV载体的启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。一种与携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括PAP重组腺相关病毒的质粒载体、PAP重组腺相关病毒的病毒载体、被所述PAP重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系，所述PAP重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带PAP抗原基因的重
组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述PAP重组腺相关病毒的病毒载体由所述PAP重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。一种与携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，PAP重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将如上述携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到PAP重组腺相关病毒的质粒载体；PAP重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述PAP重组腺相关病毒的质粒载体和pHelper质粒共转染AAVp细胞得到PAP重组腺相关病毒的病毒载体；PAP重组腺相关病毒感染或转染的细胞系的制备：用所述PAP重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染单核细胞或树突状细胞得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系(所述AAV/PAP中的相关基因—PAP抗原基因可在单核细胞-树突状细胞系中在转录启动子的作用下获得表达)。一种如上所述的携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体或者如上所述的相关产品在制备抗PAP抗原阳性的前列腺癌药物中的应用。药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携带前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为PAP抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。
【技术特征摘要】
2015.06.17 CN 20151033670891.一种携带前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为PAP抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：所述重组腺相关病毒载体中的启动子为AAV p5启动子、巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子中的一种。3.一种携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入PAP抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：还包括以下步骤：将所述腺相关病毒的p5启动子替换为下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)获取PAP cDNA；2)将已构建的携带有启动子的AAV 2型pBR322质粒和步骤1)得到的PAP cDNA进行限制性内切酶反应，然后进行DNA连接反应，得到携带有启动子和PAP cDNA的重组腺相关病毒载体。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中包括以下步骤：11)从前列腺癌组织中提取PAP的总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；12)以所述总cDNA为模板，在引物1：CATGAGAGCTGCACCCCTCC和引物2：CTAATCTGTACTGTCCTCAGT的引导下进行PCR扩增，得到所述PAP cDNA。7.一种与携带PAP抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，其特征在于：所述产品为PAP重组腺相关病毒的质粒载体、PAP重...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，史鹏燕，董文娟，高洪吉，李帆，冯雪，
申请(专利权)人：深圳益世康宁生物科技有限公司，刘勇，
类型：发明
国别省市：广东;44
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