检测糖类抗原的试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测糖类抗原的试剂盒及其检测方法和应用，属于体外诊断检测技术领域。该试剂盒包括以下组分：1)磁性微球体系：包括有直接连接或间接连接糖类抗原的抗体1的磁性微球；2)第一标记物体系：包括有直接连接或间接连接第一标记示踪物或第二标记示踪物的糖类抗原的抗体2；3)第二标记物体系：包括有直接连接或间接连接第一标记示踪物或第二标记示踪物的糖类抗原的抗体2；所述糖类抗原的抗体1和糖类抗原的抗体2的抗体位点互不相同。采用本发明专利技术的试剂盒和检测方法来检测糖类抗原，具有灵敏度高和不会产生HOOK效应的优点。

【技术实现步骤摘要】
检测糖类抗原的试剂盒
本专利技术涉及体外诊断检测
，特别是涉及一种检测糖类抗原的试剂盒及其检测方法和应用。
技术介绍
肿瘤已对人类生存构成了严重的威胁，治疗肿瘤的关键在于及时发现，及早治疗以及治疗后复查。糖类抗原是临床上应用广泛的一类肿瘤标志物，它包括糖蛋白与脂糖，常表现为粘蛋白形式。其抗原决定簇可定位在糖链上或者在蛋白核上。根据糖基表位的不同和抗原表位大小的差异，一般可分为CA50、CA125、CA153、CA199、CA242、CA724，人体本来糖类抗原含量是非常微量的，甚至没有，但是当恶性肿瘤发生时可能会诱发机体分泌高浓度的糖类抗原，因此糖类抗原可为肿瘤的前期筛查、临床诊断、疗效监控、癌细胞转移以及术后复查提供数据依据。目前糖类抗原的测定原理主要是双抗体夹心法，主要包括酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫(RIA)、化学发光免疫分析(CLIA)等。但是ELISA与RIA两种方法存在诸多不足，例如：ELISA存在测定灵敏度低，容易交叉污染等缺点；RIA则存在放射性污染，标记物半衰期短，操作时间长等缺点。但随着标记技术的发展，化学发光免疫分析(CLIA)是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术，化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。其中，化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将标记物质直接标记在抗原或抗体上，经过特异性反应后形成抗原—抗体复合物，然后进行相应标记物的检测方法检测。CLIA的主要优点是灵敏度高、线性范围宽、标记物的有效期长、无放射性危害、可实现全自动化等。但是，常规技术中测定糖类抗原的化学发光免疫体外诊断试剂存在对抗原浓度极高样本测不准或灵敏度不高的问题。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测糖类抗原的试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒和检测方法来检测糖类抗原，既能提高样本检测的灵敏度，又不会测不准抗原浓度极高的样本。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种检测糖类抗原的试剂盒，包括以下组分：1)磁性微球体系：包括有直接连接或间接连接糖类抗原的抗体1的磁性微球；2)第一标记物体系：包括有直接连接或间接连接第一标记示踪物或第二标记示踪物的糖类抗原的抗体2；3)第二标记物体系：包括有直接连接或间接连接第一标记示踪物或第二标记示踪物的糖类抗原的抗体2；所述糖类抗原的抗体1和糖类抗原的抗体2的抗体位点互不相同。上述“直接连接”为直接结合的连接，上述“间接连接”为通过生物素和链霉亲和素，或异硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体等能够相互结合的搭桥物以间接结合的方式连接。上述第一标记物体系和第二标记物体系中，既可以选用相同的标记物体系，也可选用不相同的标记物体系。其中，不相同的标记物体系，既可以是其中标记示踪物的浓度不同，也可以是标记的标记示踪物不同。所述抗体既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，但在第一标记物体系和第二标记物体系中的抗体需为抗体位点相同的同株抗体。本专利技术人发现，常规技术中的化学发光免疫糖类抗原体外诊断试剂存在测不准抗原浓度极高的样本，是由于采用的是一步法，即在加入包被抗体磁性微球的同时加入标记标记示踪物的抗体，温育反应结束后形成抗体-抗原-抗体的“三明治”复合物。如样本中抗原浓度极高时会出现明显的HOOK效应，即当样本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和包被抗体磁性微球及标记上标记示踪物的抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量而导致出现HOOK效应。而对于灵敏度不高的问题，则是由于采用了两步法，即在第一步加样中，仅加入包被抗体磁性微球，使抗原充分和包被抗体磁性微球反应结合，清洗后再第二步加样，加入标记上标记示踪物的抗体，形成抗体-抗原-抗体的“三明治”复合物，虽然避免了出现HOOK效应的可能，但是，该两步法的第一步加样反应中，只是样本中的抗原和包被抗体磁性微球反应，没有形成抗体-抗原-抗体结合的“三明治”复合物，因此在清洗过程中会损失掉一定的抗原，造成检测灵敏度的降低。在上述研究发现的基础上，本专利技术在上述一步法和两步法的基础上进行了改进，在该试剂盒中设置第一标记物体系和第二标记物体系，使用该试剂盒检测糖类抗原时，首先进行一次加样，将待测样本与第一标记物体系和磁性微球体系混合，温育反应后清洗，再进行二次加样，再次加入第二标记物体系，彻底形成抗体-抗原-抗体结合的双抗夹心复合物，再进行检测，从而既避免了产生HOOK效应的问题，又避免了清洗过程中会损失一定抗原，造成灵敏度下降的问题。适用于本专利技术的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。优选的是，本专利技术使用的磁球，是将纳米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可根据需要进行选择。本专利技术所使用的磁性微球应能满足直径为0.1-5μm，磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。在其中一个实施例中，所述磁性微球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径，并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。在上述技术方案中，磁性微球体系中，磁性微球的工作浓度优选0.1-0.5mg/ml，糖类抗原的抗体1的工作浓度优选25-300μg/L；标记物体系中，第一标记示踪物或第二标记示踪物的工作浓度优选0.625-5μg/L，糖类抗原的抗体2的工作浓度优选2-100μg/L。将各试剂成分的浓度设定在此范围内，既能避免由于浓度过低导致光信号低，影响试剂检测的灵敏度；又能避免浓度过高所造成的成本浪费。可根据具体情况调整。可以理解的，为了达到定量测定的目的，该试剂盒还可以包括糖类抗原浓度为5-20U/ml的校准品溶液和浓度为200-7000U/ml的校准品溶液。同样可以理解的，该试剂盒中的各组分均含有BSA(牛血清白蛋白)和防腐剂，BSA的浓度为0.01-0.5g/ml，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或两种以上混合物。在其中一个实施例中，所述第一标记物体系和第二标记物体系中所用的标记示踪物相同。即均为第一标记示踪物或均为第二标记示踪物。采用相同的标记示踪物，其发光效率是一致的，能够具有更好的检测准确性。在其中一个实施例中，所述糖类抗原为CA50、CA19-9、CA242、CA724、CA153、或CA125。可根据检测目的进行选择。上述标记示踪物包括以下几种：1、化学发光免疫分析使用的能够直接发光的标记物，如鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物、吖啶酯等；2、化学发光酶免疫分析使用的配合相应底物可以发光的标记物，如碱性磷酸酶或过氧化物酶等。在其中一个实施例中，所述标记示踪物为发光标记物，选自：金刚烷、鲁米诺及其衍本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测糖类抗原的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：1)磁性微球体系：包括有直接连接或间接连接糖类抗原的抗体1的磁性微球；2)第一标记物体系：包括有直接连接或间接连接第一标记示踪物或第二标记示踪物的糖类抗原的抗体2；3)第二标记物体系：包括有直接连接或间接连接第一标记示踪物或第二标记示踪物的糖类抗原的抗体2；所述糖类抗原的抗体1和糖类抗原的抗体2的抗体位点互不相同。

【技术特征摘要】
1.一种检测糖类抗原的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：1)磁性微球体系：包括有直接连接或间接连接糖类抗原的抗体1的磁性微球；2)第一标记物体系：包括有直接连接或间接连接第一标记示踪物或第二标记示踪物的糖类抗原的抗体2；3)第二标记物体系：包括有直接连接或间接连接第一标记示踪物或第二标记示踪物的糖类抗原的抗体2；所述标记示踪物为发光标记物，选自：鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯；所述糖类抗原的抗体1和糖类抗原的抗体2的抗体位点互不相同；所述第一标记物体系和第二标记物体系中所用的标记示踪物相同。2.根据权利要求1所述的检测糖类抗原的试剂盒，其特征在于，所述糖类抗原为CA50、CA19-9、CA242、CA72-4、CA15-3、或CA125。3.根据权利要求1所述的检测糖类抗原的试剂盒，其特征在于，所述1)磁性微球体系中，所述间接连接糖类抗原的抗体1的磁性微球由包被链霉亲和素的磁性微球，和标记生物素的糖类抗原的抗体1组成。4.根据权利要求1所述的检测糖类抗原的试剂盒，其特征在于，所述1)磁性微球体系中，所述间...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶微，李婷华，徐浩明，李海容，胡运标，袁锦云，
申请(专利权)人：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44