一种携带精子蛋白17抗原基因的重组腺相关病毒载体及其应用价值制造技术

本发明专利技术公开了一种携带人精子蛋白17(Sperm protein 17，SP17)抗原基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体，并证明了其应用价值。该rAAV载体是将SP17抗原基因插入本发明专利技术人构建的AAV出发载体得到的。本发明专利技术的研究证明rAAV的病毒载体可有效地将其携带的SP17抗原基因输送入人单核细胞‑树突状细胞系中，可用于刺激细胞免疫的效应细胞，即SP17抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生。实验证明，被本发明专利技术的携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体感染的DC所诱导的CTL可有效地裂解SP17抗原阳性的恶性肿瘤细胞。因此，本发明专利技术的携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体或其相关产品具有实用价值，可被用于制备SP17抗原特异性CTL，杀灭SP17抗原阳性的恶性肿瘤细胞，用于抗SP17抗原阳性的恶性肿瘤的靶向性T细胞免疫治疗。

A recombinant adeno-associated virus vector carrying sperm protein 17 antigen gene and its application value

【技术实现步骤摘要】
一种携带精子蛋白17抗原基因的重组腺相关病毒载体及其应用价值
本专利技术涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带精子蛋白17(spermprotein17,SP17)抗原基因的重组腺相关病毒载体以及其在制备抗SP17阳性的肿瘤药物中的应用。
技术介绍
腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(SamulskiRJ,SrivastavaA,BernsKI,MuzyczkaN.Rescueofadeno-associatedvirusfromrecombinantplasmids:genecorrectionwithintheterminalrepeatsofAAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因(HermonatPL,LabowMA,WrightR,BernsKI,MuzyczkaN.Geneticsofadeno-associatedvirus:isolationandpreliminarycharacterizationofadeno-associatedvirustype2mutants.JVirol.51:329-339.Hermonat,P.L.,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和rep基因之间的p5启动子(LabowMA,HermonatPL,BernsKI.Positiveandnegativeautoregulationoftheadeno-associatedvirustype2genome.JVirol.160:251-258.)。1984年，美国PaulL.Hermonat证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病是帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型(AAV-I)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV可分为12种血清型(AAV-1～AAV-12)。其中，2型腺相关病毒载体(AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括Rep和Cap基因。SP17抗原是一种肿瘤-睾丸抗原(Cancer/testisantigen，CT抗原)，生理情况下只表达于睾丸，而在其他正常组织中极少表达。近年科学研究发现在卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌以及骨髓瘤等恶性肿瘤中异常表达，提示SP17抗原对于恶性肿瘤的诊断，治疗效果及预后评估具有重要的意义。而且由于睾丸组织无人白细胞抗原(Humanleukocyteantigen,HLA)或人主要组织相容性复合物(MHC)分子,故其表达的SP17抗原不会引起机体免疫反应。由于SP17抗原具有这些特点,使SP17抗原成为抗肿瘤免疫治疗的十分重要的靶点。树突状细胞(dendriticcells,DC)具有强大的发动免疫反应的功能，是最主要的抗原提呈细胞。而细胞免疫反应，即产生抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes)，在抗恶性肿瘤和病毒感染中发挥非常重要的作用。但大量的研究资料证明无论是抗原蛋白还是抗原肽刺激DC的效率不高，并导致由DC诱导产生抗原特异性CTL反应的能力不足，使得抗恶性肿瘤和病毒感染的效果不佳。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种能够高效并持续性刺激DC的携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus，rAAV)载体，并证明其应用价值。本专利技术的技术问题通过以下的技术方案予以解决：一种携带SP17抗原基因的rAAV载体，将本专利技术人构建的出发载体--腺相关病毒(AAV)载体中已经被剔除的结构基因的位置上插入SP17抗原基因，得到rAAV载体。已知的AAV载体具有p5启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将SP17抗原基因插入已经成功构建的启动子为巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子中的一种的AAV载体中。本专利技术所使用的携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法为在出发载体，即AAV载体的已经被剔除结构基因的位置上，在限制性内切酶BglII和XhoI位点之间插入SP17抗原基因，得到携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒质粒。具体为，使用基因重组的方法，以BglII和XhoI分别将AAV载体DNA和SP17cDNA切断，再运用DNA连接技术，将酶切后的SP17cDNA和AAV载体DNA进行连接，得到携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒质粒。其启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。一种与携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒质粒、具有感染性的携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒，即病毒载体。所述携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒质粒由上述基因重组技术构建制得；所述携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体由将所述携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒质粒进行转染细胞，并进行细胞培养获得。携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法为，携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒质粒的制备：将如上述构建的携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒质粒导入基因工程大肠杆菌感受态细胞，用含氨苄青霉素的培养基进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，可获得到大量的携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒质粒；具有感染性的携带SP17抗原基因的重组腺相关病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：重组腺相关病毒载体中无腺相关病毒的结构基因，仅为含有SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体。/n

【技术特征摘要】
20181102 CN 20181130358781.一种携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：重组腺相关病毒载体中无腺相关病毒的结构基因，仅为含有SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体。


2.根据权利要求1，携带SP17抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法为：
从SP17抗原阳性的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，获得总cDNA。在上游引物(ATAGATCTGATGTCGATTCCATTCTCCAACAC)和下游引物(ATCTCGAGCCAGTGTCCTCACTTGTTTTCC)的引导下进行PCR扩增，获得带有BglII和XhoⅠ限制性内切酶识别序列的SP17cDNA。再将该SP17cDNA插入本发明人已经成功构建的腺相关病毒载体。是在剔除腺相关病毒的结构基因的位置上，插入SP17抗原基因，得到重组腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，江孝青，常爱全，高雪，王圆，高洪吉，张慧，
申请(专利权)人：深圳益世康宁生物科技有限公司，刘勇，
类型：发明
国别省市：广东;44