本发明专利技术公开了一种可控性上调ACE2靶向性防治低氧性肺动脉高压的表达载体。本发明专利技术构建了HRE增强、Tie2启动子驱动的ACE2表达载体，通过Tie2启动子特异定位于血管内皮细胞，同时，利用HIF‑1α只在低氧的肺血管内皮细胞表达特异性激活HRE，从而上调ACE2的表达。本发明专利技术发现所构建的表达载体不仅具有靶向性，而且可以根据缺氧程度可控和有效地上调ACE2在低氧的肺微血管内皮细胞中的表达，进而调控肺动脉平滑肌细胞，实现低氧可控性、靶向性地抑制肺动脉的收缩和逆转肺动脉的结构重建，为防治低氧性肺动脉高压等疾病提供有效手段和策略。
Expression vector of ACE2 targeted prevention and treatment of hypoxic pulmonary hypertension
【技术实现步骤摘要】
可控性上调ACE2靶向性防治低氧性肺动脉高压的表达载体
本专利技术涉及应用基因重组技术治疗低氧性肺动脉高压领域，具体涉及HRE增强的Tie2启动子驱动的血管紧张素转换酶2(ACE2)表达载体的构建方法。
技术介绍
低氧性肺动脉高压(HPH)是多种呼吸系统疾病、慢性高原疾病和与低氧血症相关的各类疾病的共同发病环节。低氧引起的低氧性肺血管收缩是机体重要的生理性反应之一，在维持低氧的肺泡周围的通气/血流比例，减少功能性分流，提高血氧饱和度方面具有重要意义。但长期、广泛的低氧性肺血管收缩，可导致肺血管结构重建。肺血管结构重建是造成肺动脉压力持续增高，及促进肺源性心脏病发生发展的关键因素。因此特异性舒张肺动脉、抑制或逆转肺血管重建是防治低氧性肺动脉高压及其并发症的主要目标。研究表明肺内肾素-血管紧张素(RAS)系统参与低氧性肺动脉高压的发生发展。低氧性肺动脉高压时，RAS的主要效应蛋白血管紧张素II(AngII)不仅强烈收缩肺血管，还显著促进肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖、肥大，是造成肺血管阻力持续增加的重要因素之一。RAS的其他成员，如肾素、血管紧张素原等也以各种途径参与到HPH的发生发展过程中。因此低氧性肺动脉高压时，肺内RAS的功能异常可能是造成低氧性肺血管收缩和结构重建的重要原因之一。最近发现RAS的新成员ACE2，是由805个氨基酸组成的膜蛋白，广泛分布于心、肺的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肺上皮细胞、心肌细胞和胃肠道、辜丸、视网膜、子宫、胎盘等组织。它的主要作用是高效的生成血管紧张素-(1-7)[Angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]。ACE2可以将血管紧张素I(AngI)先降解生成Ang-(1-9)，Ang-(1-9)接着在中性肽链内切酶和脯氨酰肽链内切酶的作用下生成Ang-(1-7)。ACE2还可以直接酶解血管紧张素II(AngII)，生成Ang-(1-7)。Ang-(1-7)通过与其特异性的Mas受体结合后发挥促进血管舒张、抗增殖、抗过度肥大等作用。通过产生大量的Ang-(1-7)，ACE2可以精细调控体内缩血管活性物质和舒血管活性物质之间的平衡。除此之外ACE2还可以通过作用于机体内各种活性物质参与维持机体的内环境稳定。因此增加肺循环内的ACE2表达，将有利于改善肺内RAS的功能紊乱，抑制低氧性肺血管收缩和逆转肺血管结构重建，进而起到有效防治低氧性肺动脉高压的作用。但是常规的给药途径缺乏特异性，导致体循环血压降低的副作用。而且长期、单一扩张肺血管，还可以导致静脉血掺杂，加重低氧血症。如何使ACE2只特异性定位于肺血管中，并只在低氧时的肺血管中表达增多，而且还可根据低氧的程度实现可控性的调节，是防治低氧性肺动脉高压的重点和关键。中国专利CN101532027(公开日：2009年9月16日)公开了一种缺氧诱导真核基因表达载体及其用途，通过对pcDNA3.1进行的改造，将其增强子用缺氧诱导的增强子替代，构建了缺氧诱导基因表达载体；为了检测缺氧诱导基因表达载体的功能，将hVEGF165的cDNA插入到载体中，构建了含hVEGF165的缺氧诱导真核基因表达载体p6HRE-hVEGF165，并将该载体转入BHK细胞中，表达hVEGF的BHK细胞在缺氧环境下培养，用ELISA的方法检测培养上清液中hVEGF的含量，结果证明缺氧诱导后hVEGF的表达量增加；将p6HRE-hVEGF165用于家兔肢体缺血性疾病的基因治疗，可有效地促进患肢新生血管和侧支循环的形成，使患肢胫动脉压恢复。但是肺循环血管与上述专利中的体循环血管具有明显不同的特性。肺血管在短期低氧时发生低氧性收缩，以维持低氧的肺泡周围的通气/血流比例，减少功能性分流，提高血氧饱和度；长期低氧则造成内皮素、5-羟色胺血管、内皮生长因子(VEGF)等血管活性物质分泌过多进而参与肺血管重构，加重肺部缺血缺氧程度，这是造成低氧性肺动脉高压的病理生理学特征。体循环血管在低氧时则明显舒张，增加血流以减轻缺血缺氧的症状。因此低氧性肺动脉高压(HPH)需要根据缺氧程度给予更精确的表达调控。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可控性上调ACE2靶向性防治低氧性肺动脉高压的表达载体。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种ACE2重组表达载体(简称HTSFCACE2)，包括低氧反应元件、启动子、信号肽(SignalPeptide)序列及ACE2编码序列，其中，所述低氧反应元件选自HRE序列，在发挥HRE作用的同时，利用启动子使ACE2的表达具有血管内皮细胞特异性。优选的，所述HRE序列的重复排列次数为1～100。优选的，所述启动子选自Tie2基因启动子。优选的，所述表达载体具体包括依次排列的6×HRE序列、Tie2基因启动子序列、信号肽及hIgG1Fc融合标记序列和ACE2编码序列。优选的，所述表达载体构建于腺相关病毒载体骨架或真核表达载体骨架上。上述表达载体的构建方法，包括以下步骤：合成6×HRE序列、Tie2基因启动子序列、信号肽及hIgG1Fc融合标记序列和ACE2编码序列；将合成的各个序列克隆到表达载体骨架(例如，pAAV-MCS)中，并将得到的重组质粒称为HRE-Tie2-FC-ACE2(简称HTSFCACE2)。将不含ACE2编码序列的重组质粒作为对照质粒，称为HRE-Tie2-FC(简称HTSFC)。上述表达载体(HTSFCACE2)在制备用于预防和/或治疗低氧性肺动脉高压和/或低氧性肺动脉高压并发症的药物中的用途。优选的，所述表达载体具有细胞靶向性，常氧(21％O2浓度)条件下仅在转染后的肺微血管内皮细胞(PMVECs)中使ACE2特异性地高表达。优选的，所述表达载体具有低氧(氧浓度低于21％，即缺氧)可控性，在不同浓度的低氧(10％、5％和1％O2)刺激下，转染后的PMVECs细胞中和细胞上清中ACE2的表达量显著增加，并且其增加率随着氧浓度的降低而升高。优选的，所述表达载体具有抑制PASMCs增殖的有效性，例如，PMVECs转染HTSFCACE2后给予10％氧浓度的低氧刺激，继续培养24h后收集的PMVECs细胞上清即为含表达载体HTSFCACE2的PMVECs低氧条件培养液，该PMVECs低氧条件培养液对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖有明显的抑制作用。优选的，包装为腺相关病毒的HTSFCACE2表达载体以滴鼻方式一次性作用于低氧性肺动脉高压大鼠后，能够降低大鼠右心室压，减轻右心室肥厚程度，抑制肺小动脉的结构改变，改善肺动脉结构重建，并且该病毒进入大鼠体内后使得ACE2只在肺组织表达增多，降低肺组织血管紧张素II(AngII)的含量，升高血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]的含量，具有组织特异性和有效性。上述表达载体(HTSFCACE2)在制备用于预防和/或治疗糖尿病坏疽、深静脉血栓、缺血性心脏病等与低氧和/或缺血相关的一系列疾病的药物中的用途。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术利本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ACE2重组表达载体，其特征在于：包括低氧反应元件、启动子、信号肽序列及ACE2编码序列，其中，所述低氧反应元件选自HRE序列，启动子具有血管内皮细胞特异性。/n
【技术特征摘要】
1.一种ACE2重组表达载体，其特征在于：包括低氧反应元件、启动子、信号肽序列及ACE2编码序列，其中，所述低氧反应元件选自HRE序列，启动子具有血管内皮细胞特异性。
2.根据权利要求1所述一种ACE2重组表达载体，其特征在于：所述HRE序列的重复排列次数为1～100。
3.根据权利要求1所述一种ACE2重组表达载体，其特征在于：所述启动子选自Tie2基因启动子。
4.根据权利要求1所述一种ACE2重组表达载体，其特征在于：所述表达载体具体包括依次排列的6×HRE序列、Tie2基因启动子序列、信号肽及hIgG1Fc融合标记序列和ACE2编码序列。
5.一种如权利要求1所述的表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
合成HRE序列、启动子序列、信号肽序列和ACE2编码序列；将合成的各个序列克隆到表达载体骨架中。
6.一种如权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘曼玲，赵澎涛，董明清，李志超，马恒，董海莹，张博，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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