抗原制造技术

提供了一种来自铜绿色假单胞菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）的抗原。也提供了该抗原在检测／诊断铜绿色假单胞菌中的用途以及其在产生一种免疫应答中的用途。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种来自铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的新型抗原，涉及其在医药、特别是在疫苗制备和诊断中的用途。铜绿色假单胞菌是一种棒状的革兰氏阴性好氧性游动细菌。它是一种环境中广泛存在的胞外条件性病原菌，在受试者上引起明显致病性和死亡率。在带有囊性纤维化、烧灼伤、慢性支气管炎、支气管扩张和癌症的受试者中有特别明显的感染。免疫应答的鉴定、候选疫苗的寻找以及用于诊断试验的合适成分均使人们的注意力集中到铜绿色假单胞菌的组成成分上。铜绿色假单胞菌的外膜含有毒素，包括脂多糖内毒素、磷脂和蛋白质。多种铜绿色假单胞菌的外膜蛋白质(Opr)已按字母命名系统命名。虽然已用这种方式表征了数种蛋白质，其中的一些蛋白质仅短暂表达，且高度依赖于可获得的养分、培养条件及抗生素的存在。目前，称为F、H2和I的三种主要的Opr已在所有铜绿色假单胞菌菌株中识别为有共同的抗原性，且以高拷贝数表达。我们目前已鉴定了一种来自铜绿色假单胞菌外膜制剂的蛋白质，我们称之为Pa60。此蛋白质的氨基末端序列不与其它先前表征过的蛋白南(Genbamk数据检索)显示任何序列同源性。此蛋白质有抗原性，且能引起导致铜绿色假单胞菌加速消除的防御性免疫应答。因此，在本专利技术的一个方面中提供了来自铜绿色假单胞菌的蛋白质抗原，如SDS-PAGE测得，其分子量范围为约60KDa至约65KDa，在一个优选的实施方案中，蛋白质具有下列N末端序列？-E-E-K-？-？-L-？-？-？-？-？-？-？-V-V-？-N-A；和优选地？-E-E-K-T-P-L-T-T-A-A-？-A-P-V-V- ？-N-A完整蛋白质的一部分或片段自身可以有抗原性，因此在第二方面，本专利技术提供了本专利技术蛋白质的抗原性片段。特别的，该抗原性片段包含如上所述的N-末端序列。本领域技术人员知晓，片段的序列上的某些变化是可能的，其仍保留抗原性特性。可用本领域技术人员周知的方法检测片段和/或其变体的抗原性。这些变体也构成本专利技术的一部分。本专利技术的抗原性蛋白质或其片段可以以纯化或经分离的制剂形式单独提供，或作为与其它铜绿色假单胞菌抗原蛋白质的混合物的部分提供。因此，在第三方面本专利技术提供了一种抗原组合物，其包含本专利技术的一种或多种蛋白质和/或其一种或多种抗原性片段。这种组合物可用于铜绿色假单胞菌的检测和/或诊断。在一个实施方案中，组合物包括一种或多种额外的铜绿色假单胞菌抗原。在第四方面，本专利技术提供了一种检测和/或诊断铜绿色假单胞菌的方法，其包括(a)将待检测的样本与本专利技术的抗原蛋白质、或其抗原性片段或一种抗原组合物接触；且(b)检测针对铜绿色假单胞菌的抗体的存在。特别的，本专利技术的蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物可用于检测IgG抗体。适当的，待检测的样本为生物学样本，如血液或唾液样本。在第五方面，本专利技术提供了在检测和/或诊断铜绿色假单胞菌中本专利技术的抗原蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物的用途。优选的，检测和/或诊断在体外进行。本专利技术的抗原蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物可以作为试剂盒的部分的形式提供，用于铜绿色假单胞菌的体外检测和/或诊断。因此，本专利技术的第六方面中提供用于检测和/或诊断铜绿色假单胞菌的试剂盒，其包括本专利技术的抗原蛋白质、其抗原性片段或抗原组合物。另外，本专利技术的抗原蛋白质或其抗原性片段可用于诱导一种针对铜绿色假单胞菌的免疫反应。因此，在又一方面，本专利技术提供了本专利技术的一种抗原、其片段或本专利技术的抗原组合物在医学上的用途。在又一方面，本专利技术提供了一种能在受试者中引发免疫反应的组合物，其包含一种本专利技术的蛋白质或其一种或多种抗原性片段。适当地，该组合物为一种疫苗组合物，任选地，其包含一种或其它合适的佐剂。这种疫苗组合物可以是预防性或治疗性的疫苗组合物。本专利技术的疫苗组合物可包括一种或多种佐剂。佐剂的例子为本领域技术人员周知，包括无机性胶体诸如氢氧化铝或油包水型乳剂，诸如弗氏不完全佐剂。其它有用的佐剂为本领域技术人员周知。在又一方面，本专利技术提供了(a)本专利技术的蛋白质或其一种或多种抗原性片段在制备一种致免疫组合物，优选地为疫苗中的用途；(b)这种致免疫组合物在诱导受试者免疫反应中的用途；和(c)一种用于在受试者中治疗或预防铜绿色假单胞菌感染的方法，其包括如下步骤向受试者施用一种有效量的本专利技术的蛋白质、至少一种抗原性片段或抗原组合物，优选的为疫苗。本专利技术各个方面的优选的特点对于每一其它方面在细节上已作必要的修正。本专利技术参照下列实施例加以描述，其不应认为以任何方式限制了本专利技术的范围。实施例中的涉及附图附图说明图1Pa60的SDS-PAGE分析。实施例1蛋白质纯化从过夜培养的100个琼脂平板上收集铜绿色假单胞菌菌株385(Pa385)的菌，方法是刮平板后，洗板两次，4℃下10,000×g离心10分钟。用经缓冲的Zwittergent3-14去污剂提取外膜组分，且用乙醇沉淀。冷冻干燥外膜提取物，重悬于出发缓冲液(20mM Tris，pH8.5)。将此制剂经Q2柱(Bio Rad)阴离子交换层析和氯化钠梯度洗脱蛋白质。从柱上洗脱的级分用分析型SDS-PAGE初步鉴定蛋白质组成。由此测定Pa60的洗脱分布图，使之从随后的柱层析中收集含有Pa60的级分用于进一步纯化。将这些级分对蒸馏水透析，冷冻干燥，重悬于最少量的蒸馏水中，且进一步溶于4倍体积的十二烷基硫酸钠(SDS)还原缓冲液(62.5mM Tris，pH6.8，10％(V/V)甘油，2％(W/V)SDS，5％(V/V)β-巯基乙醇，1.2×10-3％(W/V)溴酚蓝)。将SDS制备物在37℃温育至少30分钟后，上样于电泳柱的堆积胶。Pa60用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化(PAGE)。利用聚合在28mm(内径)柱中9％T-1.42％C丙烯酰胺/BIS(N，N′ -亚甲基-双丙烯酰胺)分离胶和10ml 4％T-0.36％C丙烯酰胺/BIS堆积胶通过BioRad 491型制备槽进行制备型SDS-PAGE。从柱中洗脱的级分经过冷冻干燥加以浓缩，且用分析型SDS-PAGE分析蛋白质成分。利用这些条件分离的Pa60所含的SDS随后用磷酸钾沉淀去除。合并含有Pa60的级分且透析，然后用于测定蛋白质浓度。利用分析型SDS-PAGE进行蛋白质的分析鉴定，方法是用10-15％的梯度丙烯酰胺凝胶或用均质12.5％的丙烯酰胺凝胶，且用考马斯蓝或银染。用Pierce微量BCA检验确定蛋白质浓度。结果通过上述方法成功地从铜绿色假单胞菌蛋白质中分离了Pa60。图1显示此蛋白质在SDS-PAGE上的位置。实施例2 Pa60的N-末端测序通过从SDS-PAGE凝胶上切割出含有该蛋白质的区域制备用于N-末端氨基酸分析的Pa60。将凝胶片段送到生物分子资源中心，澳大利亚国立大学，堪培拉，澳大利亚和MUCAB中心，Macquarie大学，North ryde，NSW，澳大利亚。结果获得了N-末端氨基酸序列，鉴定了前十九个氨基酸中的十六个。鉴定了其余的残基和用可能的鉴定不能确定处之可能的氨基酸。序列12345678910确定的 EEK L或然的T P TTA可能的S A L/SAI/D W11 12 13 14 15 16 17 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来自铜绿色假单胞菌的外膜蛋白质抗原，其具有范围从约６０ＫＤａ至约６５ＫＤａ的分子量，如ＳＤＳ－ＰＡＧＥ所测。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：AW克里普斯，J基德，M邓克利，RL克兰西，
申请(专利权)人：奥斯法姆国际有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]