本发明专利技术公开了一种携带生存素(Survivin，又称存活素)抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与其应用。该rAAV载体是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为Survivin抗原基因得到。本发明专利技术的rAAV的病毒载体可将其携带的Survivin抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明专利技术的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在体外或患者体内可有效地抑制Survivin抗原阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明专利技术的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗多种Survivin抗原阳性肿瘤的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带生存素(Survivin，又称存活素)抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗Survivin阳性的肿瘤药物中的应用。
技术介绍
腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(SamulskiRJ,SrivastavaA,BernsKI,MuzyczkaN.Rescueofadeno-associatedvirusfromrecombinantplasmids:genecorrectionwithintheterminalrepeatsofAAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因(HermonatPL,LabowMA,WrightR,BernsKI,MuzyczkaN.Geneticsofadeno-associatedvirus:isolationandpreliminarycharacterizationofadeno-associatedvirustype2mutants.JVirol.51:329-339.Hermonat,P.L.,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和rep基因之间的p5启动子(LabowMA,HermonatPL,BernsKI.Positiveandnegativeautoregulationoftheadeno-associatedvirustype2genome.JVirol.160:251-258.)。1984年，美国PaulL.Hermonat证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病是帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型(AAV-I)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV可分为12种血清型(AAV-1～AAV-12)。其中，2型腺相关病毒载体(AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括Rep和Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus，rAAV)。如何构建可用于制备治疗疾病的药物的重组腺相关病毒及其相关产品是本领域技术人员努力的方向。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种稳定性高、携带生存素(Survivin)抗原基因的重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus，rAAV)载体及其构建方法与应用。本专利技术的技术问题通过以下的技术方案予以解决：一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体，将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为Survivin抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。已知的腺相关病毒载体具有p5启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将Survivin抗原基因插入已经成功构建的启动子为巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子中的一种的AAV载体中。本专利技术还提供携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入Survivin抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。本专利技术所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将AAV载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因Survivin与被切断的AAV载体DNA进行连接，得到携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体。该rAAV载体的启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。一种与携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括Survivin重组腺相关病毒的质粒载体、Survivin重组腺相关病毒的病毒载体、被所述Survivin重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系，所述Survivin重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述Survivin重组腺相关病毒的病毒载体由所述Survivin重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。一种与携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，Survivin重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将如上述携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到Survivin重组腺相关病毒的质粒载体；Survivin重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述Survivin重组腺相关病毒的质粒载体和pHelper质粒共转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为Survivin抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。
【技术特征摘要】
1.一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病
毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为Survivin抗原基因得到的重组腺相关病毒载
体。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：所述腺相关病毒的
p5启动子替换为下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子、
SV40早期启动子。
3.一种携带Survivin抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于：
在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入Survivin
抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：还包括以下步骤：将所述腺相
关病毒的p5启动子替换为下述三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋
白启动子、SV40早期启动子。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)改建AAV2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98I和HpaI将AAV2
型pBR322质粒中的AAV2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切
酶EcoRI和EcoRV酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒
中，保留两端的TR序列或者在两端的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入由9个
核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；
2)将启动子插入步骤1)得到的改建的AAV2型pBR322质粒中，构建携带有启
动子的AAV2型pBR322质粒；所述启动子为p5启动子或者下述三种启动子中的一种：
巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子；
3)获取SurvivincDNA；
4)将步骤2)构建的质粒和步骤3)得到的SurvivincDNA分别用限制性内切酶
MluI和xbaI进行酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带有启动子和Survivin抗
原基因的重组腺相关病毒载体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中包括以下步骤：
\t31)从Survi...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，董文娟，高洪吉，史鹏燕，
申请(专利权)人：深圳益世康宁生物科技有限公司，刘勇，
类型：发明
国别省市：广东;44
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