使用AAV衣壳变异体的高度有效的基因转移的组合物和方法技术

本发明专利技术公开了用于AAV介导的基因治疗的改进的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术公开了用于AAV介导的基因治疗的改进的组合物和方法。【专利说明】使用AAV衣壳变异体的高度有效的基因转移的组合物和方 法 本申请要求分别于2012年4月18日和2013年3月15日提交的美国临时专利申 请第61/635, 273和61/794, 995号的优先权，各专利申请的全部内容以似乎完整地陈述的 参考方式并入本文中。
本申请涉及基因治疗和分子生物学领域。更具体地，本专利技术提供包含蛋白质衣壳 变异体的AAV载体，该蛋白质衣壳变异体提高包含治疗上有利的转基因的AAV载体的转导 效率。
技术介绍
本说明书的全文中引用若干公开物和专利文件，以便描述本专利技术所属领域的状 态。这些引用文件中的每一个以似乎完整地陈述的参考方式并入本文中。 腺相关病毒（AAV)的一种小的（20nm)复制缺陷的无包膜病毒。已在人和非人灵长 类动物中鉴定出许多不同的AAV血清型。AAV基因组是由在两端具有145bp的末端反向重 复（ITR)的单链DNA所构成。存在两个开放阅读框（ORF) :R印和Cap。虽然R印产物对于 AAV复制是必不可少的，但有3种衣壳蛋白（VP1、VP2、和VP3)是由Cap基因表达。VP1、VP2 和￥?3以1 :1:10的比率共同地形成二十面体衣壳（乂丨6〇6七&1，2002)。在重组44￥〇^八￥) 载体产生期间，将由ITRs旁侧（flank)的表达盒被包装入AAV衣壳中。AAV的复制所需的 基因不包含在该表达盒中。重组AAV被认为是最安全的，并且是最广泛使用的用于体内基 因转移的病毒载体之一。这些载体可以感染来自于提供强的和持续的转基因表达的多种组 织类型的细胞。它们也是非致病的，并且具有低的免疫原性（High KA，2011)。 基因治疗试验的一个直接目的是优化载体以在使载体剂量最小化的同时使组织 转导最大化。当进入细胞时，AAV衣壳蛋白经历蛋白酶体介导的降解。AAV衣壳的表面暴露 酪氨酸残基的磷酸化代表了经由泛素-蛋白酶体途径导致病毒降解的第一步骤中的一个 步骤（Zhong L et al，2007)。细胞中大部分的受控蛋白水解是经过此途径而发生。泛素是 在所有真核细胞中均可以发现的小蛋白质（约8. 5kDa)。泛素连接到底物蛋白氨基酸的侧 链。在其它泛素蛋白质经由最初连接的泛素连接到底物之后，形成多聚泛素链并且标记底 物用于降解（Thrower JS et al 2000，Peng J et al 2003，Bedford L et al，2011)。已证 明表面暴露酪氨酸残基的突变导致AAV 2载体的转导效率的提高（Zhong L et al，2008)。 最近，若干个研究小组已证明该方案也可有效地用于在若干组织中的其它AAV血清型，包 括AAV血清型6和8。 显然，在本领域中对于在有需要的患者中改善携带临床上重要的转基因的AVV的 转导的组合物和方法存在着需求。
技术实现思路
根据本专利技术，提供了新型的腺相关病毒变异体，该变异体当与缺乏本文中公开的 修饰的AAV血清型（例如，44￥1、44￥244￥8、44￥-1^74)相比时显示提高的转导效率。这种 改进的载体可用于包括肝脏、肌肉、大脑和视网膜在内的多种组织的转导。 在一个实施方式中，提供腺相关病毒（AAV)载体，该载体包含改变的VPl衣壳蛋 白，该改变的VPl衣壳蛋白包含赖氨酸残基替换（substitution),由此降低衣壳的泛素化 并提高将变异体AVV转导入靶组织和细胞中的转导效率。在一个实施方式中，载体还包含 异源核酸（例如，包含AAV末端反向重复和异源核酸序列的小基因），该异源核酸可操作地 连接到调控序列，该调控序列引导宿主细胞中由异源核酸序列对产物的表达。在一个优选 的实施方式中，AAV载体包含如在本文中所给出的表中提供的VPl中的一个或多个赖氨酸 替换。在另一个实施方式中，AAV载体属于AAV8血清型，并且含有表3中示出的改变。 在一个优选实施方式中，包含变异体衣壳蛋白的本专利技术的AAV载体可用于治疗性 肽或者治疗性核酸的表达。这种肽类包括但不限于：抗病毒RNAi分子、第八因子、第九因子 或者其功能性片段。其它的表达产物包括例如：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、嵌合免疫球蛋白、 人源化抗体、或者单链抗体。在一个方面，表达产物是可用于抑制HCV(丙型肝炎病毒）感 染和复制的RNAi。在另一个实施方式中，表达产物是可用于下调所研究的靶细胞的反义核 酸。 在本专利技术的另一个实施方式中，提供包含在生物学相容载体中的本专利技术的变异体 AAV载体的药物组合物。本专利技术还涉及包含本文中所公开载体的细胞培养物。 本专利技术还涉及一种将转基因传递至受试对象中的细胞的方法；所述方法包括如本 文中所公开的使细胞与AAV载体接触的步骤，其中所述AAV载体包含转基因，其中所述载体 中的VPl衣壳序列中的赖氨酸替换（substitution)与降低的泛素化以及提高的转导效率 有关。 在最后的方面，本专利技术提供诱饵病毒变异体，该诱饵病毒变异体不足以感染细胞， 但可有效地阻断携带有利的转基因的病毒变异体的抗体中和，原因在于这两种病毒变异体 的结构相似性。用于此目的的示例性衣壳变异体包括例如K38R、K143R、K510R和K709R。 【专利附图】【附图说明】 图1 :在这里所使用的AAVl、AAV2和AAV8的表面上的赖氨酸：所使用的AAV血清 型的PDB数量如下： AAV1:3NG9、AAV2:1LP3、和AAV8:2QA0。箭头代表各自的赖氨酸残基。（A)在AAV1VP3 的表面上有11个赖氨酸。残基的颜色如下：K258红、K459蓝、K491黄、K493品红、K508青、 K528深肉色、K533淡绿、K545淡蓝（蓝灰色）、K567深肉色、K666淡青、K707灰。（B)在 AAV2VP3的表面上有10个赖氨酸。残基的颜色如下：K258红、K490黄、K507青、K527深肉 色、K532淡绿、K544淡蓝（蓝灰色）、K549淡黄、K556浅品红、K665淡青、K706灰。（C)在 AAV8VP3的表面上有8个赖氨酸。残基的颜色如下：K259红、K333绿、K510青、K530深肉 色、K547淡蓝（蓝灰色）、K569深肉色、K668淡青、K709灰。应注意AAVl的K567以及K528 和AAV8的Κ530以及Κ569在结构中为并排的，并且显示具有相同的颜色。 图2 :将AAV8衣壳的若干赖氨酸残基突变为精氨酸。在动物经过尾静脉注射病毒 8周后从这些动物中采集血液。利用ELISA检测hF. IX水平（A)利用软件预测以高和中等 置信度水平被泛素化的残基突变为精氨酸。经过尾静脉给每只小鼠注射2. 5X 101°个病毒 颗粒（B、C)。利用软件预测以低置信度被泛素化的残基突变为精氨酸。经过尾静脉给每只 小鼠注射2. 5 X IO9个病毒颗粒。（B) K569R和K668R衣壳突变（C)对K38R、K143R、K259R、 K510R、K547R衣壳突变的影响与对K530R突变的影响进行比较。 图3 :K向R衣壳突变的组合（A)K137R、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改进的腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含VP1衣壳蛋白，所述VP1衣壳蛋白包含一个或多个赖氨酸替换，所述载体还包含小基因，所述小基因包含AAV反向末端重复和能操作连接到调控序列的异源核酸序列，所述调控序列引导在宿主细胞中由所述异源核酸序列对产物的表达，所述赖氨酸替换对于抑制所述衣壳蛋白的泛素化是有效的，由此增加所述AAV载体向靶细胞中的转导。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：穆斯塔法·N·雅思斯格鲁，费德里科·麦格兹，泽维尔·安谷拉，凯瑟琳·A·海，
申请(专利权)人：费城儿童医院，
类型：发明
国别省市：美国;US