双重聚糖结合AAV载体的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及双重聚糖结合AAV载体的方法和组合物。具体地，本发明专利技术提供了包含腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白的方法和组合物，所述AAV衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中所述取代将新的聚糖结合位点引入AAV衣壳蛋白内。

Method and composition of double glycan combined with AAV carrier

【技术实现步骤摘要】
双重聚糖结合AAV载体的方法和组合物本申请是申请日为2014年3月14日的中国专利申请201480025514.0“双重聚糖结合AAV载体的方法和组合物”的分案申请。优先权声明本申请根据35U.S.C.§119（e）要求于2013年3月15日提交的美国临时申请序列号61/802,111的权益，所述美国临时申请的完整内容通过引用并入本文。政府支持声明本专利技术根据由美国国立卫生研究院（NationalInstitutesofHealth）授予的授权号R01HL089221、P01HL112761和R01AI072176在政府支持下进行。美国政府在本专利技术中拥有一定权利。
本专利技术涉及来自腺伴随病毒（AAV）的经修饰的衣壳蛋白、包含其的病毒衣壳和病毒载体及其使用方法。
技术介绍
病毒-聚糖相互作用是宿主细胞侵入的关键决定因素。细胞表面碳水化合物例如唾液酸、神经节苷脂或硫酸类肝素由大量病毒采用，所述病毒例如流感、疱疹病毒、SV40、多瘤病毒、乳头状瘤病毒及其他病原体1,2。在大多数情况下，单个类别的聚糖主要充当病毒的细胞表面附着因子，导致其他受体/辅受体的序贯或平行衔接用于细胞进入。腺伴随病毒（AAV）是辅助依赖性细小病毒，其采用硫酸类肝素（HS）、半乳糖（Gal）或唾液酸（Sia）作为细胞表面结合的主要受体3,4。例如，AAV血清型2和3b利用HS；AAV1、4和5以不同连接特异性结合Sia，而AAV9采用Gal用于宿主细胞附着。不同的AAV毒株还需要与辅受体的后续相互作用用于细胞摄取，所述辅受体例如整联蛋白αVβ5或α5β1、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）、血小板来源的生长因子受体（PDGFR）、表皮生长因子受体（EGFR）、肝细胞生长因子受体（HGFR）或层粘连蛋白受体3,4。特定AAV毒株和单个类别的碳水化合物之间的单配关系的显著例外是AAV血清型6，其识别Sia和HS5。然而，仅Sia已显示是病毒转导必需的。结构研究目前已确定在AAV6衣壳的VP3亚基中与R488、K528和K533结合的K531残基构成HS葡萄氨基葡聚糖的静电识别的连续基本片(patch)6-8。类似地，通过AAV2和AAV3b的HS识别的结构基础是众所周知的，并且归于位于三重对称轴处的碱性氨基酸残基的相似簇9-12。AAV1、AAV4、AAV5和AAV6的Sia结合足迹（bindingfootprint）仍有待确定。最近以来，涉及通过AAV9衣壳的Gal识别的关键氨基酸残基通过使用分子对接和定点诱变的组合进行鉴定13。需要的是具有多重聚糖结合能力的病毒载体，以采用替代途径用于细胞进入和转导。本专利技术通过提供具有多重聚糖结合位点的经修饰的衣壳蛋白、包含这些衣壳蛋白的AAV载体和其用作治疗载体的方法，克服了本领域中的前述缺点。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了包含一个或多个氨基酸取代的腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白，其中所述取代将新的聚糖结合位点引入AAV衣壳蛋白内。在一些实施方案中，氨基酸取代在AAV2中的氨基酸266、氨基酸463-475和氨基酸499-502中，或者AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV10中的相应氨基酸位置中。在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可以是己糖结合位点，其中所述己糖是半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）或岩藻糖（fuc）。在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可以是唾液酸（Sia）结合位点，其中所述Sia残基是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）或N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。在一些实施方案中，新的聚糖结合位点可以是二糖结合位点，其中所述二糖是以形式Sia（α2,3）Gal或Sia（α2,6）Gal与半乳糖连接的唾液酸。在一些实施方案中，取代将来自第一AAV血清型的新的聚糖结合位点引入第二AAV血清型的衣壳蛋白内，所述第二AAV血清型不同于所述第一AAV血清型。本专利技术还提供了包含本专利技术的AAV衣壳蛋白的AAV衣壳。本文进一步提供的是包含本专利技术的AAV衣壳的病毒载体，以及包含在药学上可接受的载体中的本专利技术的AAV衣壳蛋白、AAV衣壳和/或病毒载体的组合物。本专利技术另外提供了将核酸引入细胞内的方法，其包括使细胞与本专利技术的病毒载体接触。细胞可以在主体中，并且在一些实施方案中，主体可以是人主体。本专利技术的这些及其他方面在下文阐述的本专利技术的说明书中更详细地描述。附图说明图1.AAV1、AAV2、AAV6、AAV8和AAV9VP3单体的结构比对。（a）AAV1（紫蓝色）、AAV2（深蓝色）、AAV6（浅品红色）、AAV8（绿色）和AAV9（褐色）的VP3单体的重叠，其中标记了环I-IX，并且指出了对称轴。（b）在AAV9上的半乳糖结合位点以及在AAV1、AAV2、AAV6和AAV8上的等价残基的覆盖的特写视图。氨基酸残基通过（a）中的色码进行标记。坐标得自VP单体（PDB登录#:AAV1-3NG9、AAV2-1LP3、AAV6-3OAH、AAV8-2QA0、AAV9-3UX1）的X射线晶体学结构。结果比对使用PyMOL执行且显现。图2.G-突变体利用Gal作为新型受体以在体外转导细胞。（a）AAV1、1G9和AAV9对中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的转导效率。在4℃下以1000vg/细胞的MOI的AAV-CBA-萤光素酶感染60分钟之前，使Pro5和Lec2细胞预冷至4℃共30分钟。在通过用冰冷的PBS的三次洗涤去除未结合的病毒粒子之后，将受感染细胞在37℃温箱中培养24小时。执行发光分析，以定量来自细胞裂解产物的萤光素酶转基因表达效率。（b）AAV2i8、2i8G9和AAV9对Pro5和Lec2细胞的转导效率。（c）AAV6、6G9和AAV9对Pro5和Lec2细胞的转导效率。（d）AAV8、8G9和AAV9对Pro5和Lec2细胞的转导效率。结果呈现为平均值±s.e.m.（n=4）。统计学显著性使用单尾斯氏t检验进行评价（n.s.，不显著；*p<0.05；**p<0.01）。图3.双重聚糖结合AAV2G9嵌合体及其亲本株AAV2和AAV9的三维模型。（A）具有分别以紫色和橙色着色的现有HS和“移植”Gal结合位点的完整AAV2G9衣壳的三维结构模型。（B-D）在AAV2（B）、AAV9（C）和AAV2G9（D）衣壳的三重对称轴处的VP3三聚体的三维表面模型的图示。涉及HS结合（AAV2VP1编号：R487、K527、K532、R585、R588）和Gal结合（AAV9VP1编号:D271、N272、Y446、N470、A472、V473、W503）的残基如（A）中突出显示。黑色三角形指示三重对称轴。图4.双重聚糖结合AAV2G9嵌合体的体外表征。（A-C）用FITC-ECL和可溶性肝素抑制AAV2（A）、AAV9（B）和AAV2G9（C）对CHOLec2细胞的转导。在用AAV2、AAV9或AAV2G9包装CBA-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来自AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV10的腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白，其包含以下氨基酸取代：/na) A266S/nb) SQAGASDIRDQSR463-475SX

【技术特征摘要】
20130315 US 61/8021111.一种来自AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV10的腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白，其包含以下氨基酸取代：
a)A266S
b)SQAGASDIRDQSR463-475SX1AGX2SX3X4X5X6QX7R，其中X1–7可以是任意氨基酸；和
c)EYSW499-502EX8X9W,其中X8-9可以是任意氨基酸;
其中(a)–(c)中的取代是AAV2或AAV1、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV10中对应氨基酸位置的取代，并且
其中所述取代将聚糖结合位点从AAV血清型9(AAV9)引入所述AAV衣壳蛋白内。


2.权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV2并且：X1是V;X2是P;X3–6是NMAV;并且X7是G并且任选地其中X8是F并且X9是A。


3.权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV2衣壳氨基酸序列，其中引入了以下取代：A266S、Q464V、A467P、D469N、I470M、R471A、D472V、S474G、Y500F和S501A。


4.前述任一项权利要求的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV2衣壳氨基酸序列，其中引入了以下取代：A266S、Q464V、A467P、D469N、I470M、R471A、D472V、S474G、Y500F和S501A，并且其中氨基酸585-590被QQNTAP取代。


5.权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV1或AAV6，并且与AAV2的463-475位对应的氨基酸位置上的取代是SX1X2X3PX4X5MX6VQX7X8，其中X1–8是任意氨基酸，任选地，X1–3是VAG,X4是S,X5是N,X6是A，并且X7是G并且X8是R,任选地，对应于AAV2中499-502位的氨基酸位置是X9FX10W，其中X9和X10是任意氨基酸，任选地，X9是E并且X10是W。


6.权利要求5的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV1或AAV6衣壳氨基酸序列，其中引入了以下取代：A267S、SRGSPAGMSVQPK464-476SVAGPSNMAVQGR,和NFTW500-503EFAW。


7.权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV3a或AAV3b，并且与AAV2的463-475位对应的氨基酸位置上的取代是SX1AGPX2X3MX4X5QX6R，其中X1–6是任意氨基酸,任选地X1是V,X2是S,X3是N,X4是A,X5是N,并且X6是G,任选地对应于AAV2中499-502位的氨基酸位置上的取代是X7FX8W,其中X7和X8是任意氨基酸,任选地X7是E并且X8是W。


8.权利要求7的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV3a或AAV3b衣壳氨基酸序列，其中引入了以下取代：A266S、SQAGPQSMSLQAR464-476SVAGPSNMAVQGR,和NFPW500-503EFAW。


9.权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV4，并且与AAV2的463-475位对应的氨基酸位置上的取代是X1X2X3X4PX5NX6X7X8X9X10X11，其中X1–11是任意氨基酸,任选地X1是S,X2是V,X3是A,X4是G,X5是S,X6是M,X7是A,X8是V,X9是Q,X10是G,并且X11是R，任选地对应于AAV2中499-502位的氨基酸位置上的取代是X12X13X14X15,其中X12-15是任意氨基酸,任选地X12是E;X13是F,X14是A,并且X15是W。


10.权利要求9的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV4衣壳氨基酸序列，其中引入了以下取代：在N261前插入SSND、TKLRPTNFSNFKK458-470SVAGPSNMAVQGR，和DSLI49...

【专利技术属性】
技术研发人员：A阿索肯，R萨穆尔斯基，
申请(专利权)人：北卡罗来纳查佩尔山大学，
类型：发明
国别省市：美国;US