一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于治疗应激性认知损伤的药物中的用途，包括上述病毒载体的药物组合物、制备上述病毒载体的方法、以及上述病毒载体在针对表观遗传调控机制的研究中和针对应激所致认知障碍的治疗中的应用，其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性蛋白质；所述治疗性蛋白为TET1(1418‑2136aa)。本发明专利技术通过人工制备具有表观遗传修饰功能的腺相关病毒，该腺相关病毒感染机体后可通过表观遗传修饰诱导BDNF等神经营养因子的表达，维持神经元存活和神经发生，促进树突棘成熟，从而起到对抗和治疗应激性认知损伤的作用。

Preparation and application of an adeno-associated virus with epigenetic modification function

【技术实现步骤摘要】
一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及其在应激性认知损伤中的应用。
技术介绍
随着现代社会生活节奏的加快和社会竞争的加剧，多数人都处在不同程度的应激负荷之下，表现为交感神经系统的过度活化和HPA轴功能亢进。流行病学调查显示，长期处于应激状态的人群其轻度认知障碍和痴呆的患病率是同年龄非应激人群的两倍以上。在确诊的认知功能障碍患者当中，超过70％伴随有HPA轴的功能紊乱。高水平应激激素可导致多个脑区出现结构和功能改变，包括海马体积缩小、椎体细胞树突棘数量减少、突触可塑性异常、齿状回神经发生受阻、前额叶皮层神经环路重塑、自发活动降低等，但临床上针对应激激素为靶点的药物尚不能够有效地预防和治疗应激相关的认知功能异常。神经营养因子包含多种不同成员，在中枢神经中分布广泛，对神经元的存活与分化、神经发生、树突结构重塑、突触形成、长时程增强的产生均具有重要的调节作用。应激条件下，海马结构中BDNF等神经营养因子表达显著降低，与成人应激性认知功能损伤具有关联。神经营养因子的表达调控机制各不相同，以BDNF为例，其启动子区具有糖皮质激素反应元件和若干CpG岛区域，可同时受激素核受体类转录因子和DNA表观遗传修饰的调节。因神经营养因子的表达调控机制目前仍不完全清楚，尚未见到通过表观遗传修饰调控其表达治疗应激性认知损伤的报道。基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。腺相关病毒载体是基因治疗中常用的病毒载体，它具有安全性良好、宿主范围广、感染效率高、制备方便且易纯化浓缩等特点。以腺相关病毒为载体的药物已经广泛应用于包括恶性肿瘤在内的多种疾病的治疗。本专利技术通过人工制备具有表观遗传修饰功能的腺相关病毒，该腺相关病毒感染机体后可通过表观遗传修饰诱导BDNF等神经营养因子的表达，维持神经元存活和神经发生，促进树突棘成熟，从而起到对抗和治疗应激性认知损伤的作用，首次解决了通过表观遗传修饰调控脑内基因表达以治疗应激性认知损伤的技术难题
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术第一方面提供包含一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于治疗应激性认知损伤的药物中的用途，其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性蛋白质；其中，所述治疗性蛋白为TET1(1418-2136aa)，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术另一方面提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括上述重组单链DNA病毒载体。本专利技术还提供一种制备上述重组单链DNA病毒载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：含TET1酶催化活性结构域真核表达载体的构建及鉴定；S2：重组质粒表达检测，将鉴定出的阳性重组质粒转染293T细胞，收集细胞提取蛋白，通过westernblot实验检测重组质粒表达情况；S3：包装腺相关病毒，将重组表达质粒pAAV-TET1(1418-2136aa)和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞，3天后收集细胞上清和细胞，裂解获得AAV颗粒，通过CsCl密度梯度离心和超滤对病毒进行浓缩和纯化，最后通过real-timePCR检测病毒的滴度。其中，步骤S1中，通过PCR获得Tet1酶催化活性结构域的编码基因，再克隆至腺相关表达载体内；特别地，所述PCR反应所采用的引物序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；特别地，所述腺相关表达载体为GV467，元件顺序为CMV-betaGlobin-MCS-EGFP-3Flag-SV40PolyA；其中，所述步骤S1中，通过PCR获得的扩增产物翻译产生的肽段为TET11418-2136aa，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术最后提供上述病毒载体在针对表观遗传调控机制的研究中以及针对应激所致认知障碍的治疗中的应用。本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术制备了包含人甲基胞嘧啶双加氧酶(Tet1)表达序列的腺相关病毒，感染哺乳动物后可高效产生Tet1蛋白，诱导感染区域DNA的表观遗传修饰。该病毒表达Tet酶效率较高，能够实现在体水平对动物局部组织产生明显表观遗传修饰作用，可以用于多种疾病的表观遗传调控研究。2、在针对表观遗传调控机制的研究中，本专利技术与现常用的甲基转移酶抑制剂相比，成本低廉，尤其在整体动物水平长时程给药时，仅需局部单次注射3×109个病毒，成本为连续腹腔注射5-aza等甲基转移酶抑制剂的三分之一至一半。同时，本专利技术所涉及的腺相关病毒，可以诱导主动地DNA去甲基化过程，不依赖于DNA复制，较甲基转移酶抑制剂起效更快，应用范围更广，可用于神经元等不可分裂细胞(图10、11)。另外，本专利技术所涉及的腺相关病毒可以诱导局部组织的DNA去甲基化，避免了全身给药导致的非特异性作用。3、使用本专利技术所构建的腺相关病毒注射应激所致认知障碍大鼠的海马区，能够明显抑制应激大鼠海马结构脑源性神经营养因子BDNF基因启动子的甲基化，增加BDNF水平，从而提升新物体识别能力、增强学习记忆能力。本专利技术所述的腺相关病毒宿主范围广，导入的人Tet1基因在哺乳动物中有很高的同源性，应用对象不仅限于大鼠、小鼠，还适用于包括人在内的其它哺乳动物，本专利技术所涉及的Tet1腺相关病毒构建方法在治疗各种应激压力所致的认知功能下降方面具有潜在的应用价值。附图说明图1：人Tet1基因的结构与扩增引物位置；图2：通过PCR方法获取Tet1目的基因的电泳鉴定，其中1为PCR产物，2为Marker；图3：构建目的基因重组表达载体所用的质粒结构；图4：重组质粒的转化鉴定，其中1：阴性对照(ddH2O)，2：阴性对照(空载自连对照组)，3：阳性对照(GAPDH)，4：Marker，自上而下依次为5kb、3kb、2kb、1.5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp、100bp，5-12：11-18号转化子；图5：相差与荧光显微镜下质粒转染293T细胞的结果；图6：质粒转染后表达的重组Tet1鉴定，其中1：分子量Marker，2：SURVIVIN-3FLAG-GFP标准品阳性对照(分子量48KDa)，3：未转染的293T细胞对照，4：转染表达的目的基因融合蛋白(分子量108KDa)；图7：应激条件下脑内海马结构神经营养因子BDNF基因启动子甲基化的变化(*：与对照相比p<0.05)；图8：应激条件下脑内海马结构神经营养因子BDNF基因表达水平的变化(*：与对照相比p<0.05)；图9：应激对大鼠认知功能的影响(*：与对照相比p<0.05)；图10：Tet1基因腺相关病毒转染对应激大鼠海马结构神经元BDNF基因启动子甲基化的影响(*：与应激组相比p<0.05)；图11：Tet1基因腺相关病毒转染对应激大鼠海马结构神经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于治疗应激性认知损伤的药物中的用途，/n其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.包含一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于治疗应激性认知损伤的药物中的用途，
其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性蛋白质。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗性蛋白为TET1(1418-2136aa)，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-2任一项所述重组单链DNA病毒载体。


4.一种制备权利要求1-2任一项所述重组单链DNA病毒载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：含TET1酶催化活性结构域真核表达载体的构建及鉴定；
S2：重组质粒表达检测，将鉴定出的阳性重组质粒转染293T细胞，收集细胞提取蛋白，通过westernblot实验检测重组质粒表达情况；
S3：包装腺相关病毒，将重组表达质粒pAAV-TET1(1418-2136aa)和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞，3天后收集细胞上清和细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢方，王雪，钱令嘉，王世达，赵云，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11