干扰猪CRTC3表达的质粒及腺病毒的构建方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种干扰猪CRTC3基因表达的质粒的构建方法，包括以下步骤：根据猪CRTC3基因序列和载体的信息设计得到3个靶序列，根据靶序列设计并合成三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物；将三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物的退火产物与BamH I和Hind III酶切的pAdM‑FH‑GFP载体连接转化，得到pAdM‑FH‑GFP‑sh(1～3)‑CRTC3重组质粒。本发明专利技术还同时提供了猪CRTC3的pAdM‑FH‑GFP‑sh1‑CRTC3质粒及腺病毒的用途：用于敲除猪肌内脂肪和皮下脂肪细胞中CRTC3基因的表达，用于研究猪糖脂代谢及相关基因表达等产生的影响。

Construction and application of plasmid and adenovirus interfering with the expression of porcine crtc3

【技术实现步骤摘要】
干扰猪CRTC3表达的质粒及腺病毒的构建方法及其用途
本专利技术涉及一种干扰猪CRTC3(cAMPresponsiveelementbindingregulatedtranscriptioncoactivators)表达的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3质粒及其腺病毒的构建方法和用途，属于生物和现代农业
的应用技术。
技术介绍
猪的脂肪组织在体内不同部位的沉积直接影响着猪的胴体性状和猪肉品质，如肌内脂肪沉积的多少影响了猪肉的肉色、风味和嫩度；皮下脂肪沉积则影响猪肉的胴体品质。猪的脂肪沉积过程主要包括脂肪前体细胞的增殖、分化和聚酯，受到脂肪沉积相关基因的调控。CRTC3是一个在脂肪组织中高度表达的基因，在小鼠上研究发现，全身敲除CRTC3促进棕色脂肪组织发育，提高能量消耗，促进了白色脂肪组织的脂解作用；在高脂饮食条件下，全身敲除CRTC3显著抑制高脂诱导的肥胖。这些结果揭示，CRTC3调控脂肪沉积。但目前CRTC3在调控猪脂肪沉积方面的研究还未见报道，其是否对皮下脂肪和肌内脂肪存在差异性调控机制仍未知。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供高效干扰CRTC3基因表达的靶序列、pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3质粒及其腺病毒的构建方法以及用途。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种干扰猪CRTC3基因表达的质粒(pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3)的构建方法，包括以下步骤：1)、根据猪CRTC3基因序列和载体的信息设计得到3个靶序列，根据靶序列设计并合成三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物(shRNA1、shRNA2、shRNA3)；2)、pCRTC3-sgRNA表达载体的构建：将三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物的退火产物与BamHI和HindIII酶切的pAdM-FH-GFP载体连接转化，得到pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒。即，为将pAdM-FH-GFP载体进行BamHI和HindIII双酶切，与shRNA(1-3)引物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌；从而得到猪CRTC3的pAdM-FH-GFP-sh(1-3)-CRTC3的重组质粒。作为本专利技术的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法的改进，还包括如下的步骤3)：将pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒(表达质粒)转染猪IPEC-J2细胞，筛选得到干扰效率最佳的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3。作为本专利技术的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法的进一步改进，步骤1)为：所述3对shRNA引物为：shRNA1：sh1-F：5-GATCCGGAAGTTCAGCGAGAAGATTGTTCAAGAGACAATCTTCTCGCTGAACTTCCTTTTTTA-3，sh1-R：5-AGCTTAAAAAAGGAAGTTCAGCGAGAAGATTGTCTCTTGAACAATCTTCTCGCTGAACTTCCG-3；shRNA2：sh2-F：5-GATCCGGCTAACATCTGCACTCAACATTCAAGAGATGTTGAGTGCAGATGTTAGCCTTTTTTA-3，sh2-R：5-AGCTTAAAAAAGGCTAACATCTGCACTCAACATCTCTTGAATGTTGAGTGCAGATGTTAGCCG-3；shRNA3：sh3-F：5-GATCCGCTCAATAAGACAGCGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCGCTGTCTTATTGAGCTTTTTTA-3，sh3-R：5-AGCTTAAAAAAGCTCAATAAGACAGCGCTTTCTCTCTTGAAGAAAGCGCTGTCTTATTGAGCG-3。作为本专利技术的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法的进一步改进：所述步骤2)中，将构建所得的pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒进行测序和PCR鉴定；PCR引物为：CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGBGH：TAGAAGGCACAGTCGAGG。作为本专利技术的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法的进一步改进：将pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3表达质粒转染到IPEC-J2细胞，48h后收集细胞样品进行westernblot和定量PCR验证效果，从而筛选获得最佳的重组质粒(干扰效率最佳的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3)；定量PCR引物为：qCRTC3-F：GACAAGCCAGGACGACAGTTqCRTC3-R：GGTGCTTCTCTTCCTTCCAA。本专利技术还同时提供了利用pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3构建腺病毒的方法：将重组质粒pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3，转染至HEK293T细胞制备腺病毒。可用于研究猪CRTC3在不同细胞中的功能。本专利技术还同时提供了猪CRTC3的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3质粒及腺病毒的用途：用于敲除猪肌内脂肪和皮下脂肪细胞中CRTC3基因的表达，用于研究猪糖脂代谢及相关基因表达等产生的影响。具体而言，本专利技术根据NCBI上的预测序列，设计3对干扰引物shRNA并构建质粒进行干扰效果验证，得到干扰效果最佳的干扰引物；构建干扰猪CRTC3基因表达的质粒，将步骤1)所得的3对sh1～3引物构建pAdM-FH-GFP-sh-CRTC3质粒，进行PCR和测序鉴定；同时，设置对照组pAdM-FH-GFP，用WesternBlot验证其干扰效果，用荧光定量PCR引物qCRTC3-F、qCRTC3-R进行PCR验证。专利技术人所在团队前期研究已克隆得到猪CRTC3的全长序列，编码区序列有1860bp，编码620个氨基酸约70kD的蛋白，同时发现猪CRTC3基因对肠上皮细胞IPEC-J2的紧密连接功能具有一定的调控作用。因此，基于上述研究基础，构建干扰猪CRTC3表达的质粒及其腺病毒，对探究猪CRTC3对猪脂肪沉积和糖脂代谢等方面的调控功能具有重要的意义。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术根据NCBI的预测序列并结合pAdM-FH-GFP载体信息，设计3对靶向干扰猪CRTC3基因表达的引物sh1～3，经过引物退化并连接到线性化的pAdM-FH-GFP载体上构建3个pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3表达质粒，转化大肠杆菌DH5α，进行筛选和鉴定。将三个干扰质粒和对照组质粒转染到IPEC-J2细胞，筛选得到干扰效果最佳的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3质粒，进一步利用293T细胞包装得到sh-CRTC3的腺病毒，该病毒可以通过荧光显微镜观察到感染效率，通过Westernblot和qPCR鉴定其效果并进行相关功能研究。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干扰猪CRTC3基因表达的质粒的构建方法，其特征是包括以下步骤：/n1)、根据猪CRTC3基因序列和载体的信息设计得到3个靶序列，根据靶序列设计并合成三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物；/n2)、pCRTC3-sgRNA表达载体的构建：将三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物的退火产物与BamH I和Hind III酶切的pAdM-FH-GFP载体连接转化，得到pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种干扰猪CRTC3基因表达的质粒的构建方法，其特征是包括以下步骤：
1)、根据猪CRTC3基因序列和载体的信息设计得到3个靶序列，根据靶序列设计并合成三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物；
2)、pCRTC3-sgRNA表达载体的构建：将三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物的退火产物与BamHI和HindIII酶切的pAdM-FH-GFP载体连接转化，得到pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒。


2.根据权利要求1所述的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法，其特征是还包括如下的步骤3)：将pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒转染猪IPEC-J2细胞，筛选得到干扰效率最佳的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3。


3.根据权利要求1或2所述的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法，其特征是：所述步骤1)为：所述3对shRNA引物为：
shRNA1：
sh1-F：5-GATCCGGAAGTTCAGCGAGAAGATTGTTCAAGAGACAATCTTCTCGCTGAACTTCCTTTTTTA-3，
sh1-R：5-AGCTTAAAAAAGGAAGTTCAGCGAGAAGATTGTCTCTTGAACAATCTTCTCGCTGAACTTCCG-3；
shRNA2：
sh2-F：5-GATCCGGCTAACATCTGCACTCAACATTCAAGAGATGTTGAGTGCAGATGTTAGCCTTTTTTA-3，
sh2-R：5-AGCTTAAAAAAGGCTAACATCTGCACTCAACATCTCTTGAATGTTGAGTGCAGATGTTAGCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：单体中，刘嘉琪，汪以真，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33