一种miRNA海绵表达载体的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种miRNA海绵表达载体的构建方法，至少包括如下步骤：（1）在表达载体骨架中引入包含第一酶切位点的接头序列；（2）将与目标miRNA相互匹配的竞争性抑核苷酸序列的两端分别引入与所述第一酶切位点相匹配的粘端；（3）将（2）中得到的序列插入到（1）中得到的表达载体中，得到miRNA海绵表达载体。本发明专利技术只需通过一次单酶切反应即可获得数量可观定向插入MBS的“海绵”，此方法即简化了实验步骤降低，又保证了MBS与载体的定向插入，从而减少了MBS无意义的反向连接，增加了miRNA海绵表达载体构建的成功率。

Construction and application of a miRNA sponge expression vector

【技术实现步骤摘要】
一种miRNA海绵表达载体的构建方法及其应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种miRNA海绵表达载体的构建方法及其应用。
技术介绍
微小RNA(microRNA，miRNA)是广泛存在生物体内长度约为19～24个核苷酸的非编码小RNA，主要功能是通过与靶基因mRNA的不完全或完全互补从而沉默或切割靶mRNA在转录后水平抑制靶基因的表达，从而介导转录后负调控。在人类基因组中miRNA的数量约为整个基因组的1％，但却能够调控至少30％以上基因的表达。miRNA大部分位于编码或非编码蛋白mRNA转录本的内含子区域，在控制器官发育、细胞分化、凋亡以及肿瘤形成与转移等方面发挥着重要的作用。近年来的研究发现miRNA参与了心血管病领域很多重要的生理和病理过程，如心脏发育、心肌重构、血管重塑、心力衰竭和心律失常等。miRNA在调控心血管相关疾病，如VSMC和内皮细胞的发育、分化和在组织中稳态等发挥着重要的调控作用。随着对microRNA生物学功能的深入理解，越来越多参与调控VSMC生物学功能和行为的microRNA也不断被发现。miRNA功能研究的常用且重要手段是功能获得和功能缺失，目前miRNA功能缺失的主要方法有基因敲除、寡核苷酸抑制剂、Sponge(海绵)技术。寡核苷酸抑制技术主要用于短期实验研究，基因敲除技术虽然可以用于长期实验研究，但有相当数目的miRNA位于蛋白编码区内或在miRNA簇中，因此基因敲除无论在时间、花费还是技术上都面临挑战；而Sponge技术包含多个针对特异性miRNA的反义结合位点，即与目标miRNA相互匹配的竞争性抑核苷酸序列(miRNAantisensebindingsites,MBS)，MBS可以有效的抑制目标miRNA的表达水平，可作为理想的替代基因敲除方法。2007年，EbertMS等首次报道miRNASponge构建方法，将含有多个串联的MBS插入到表达载体中，在细胞中表达后，可以特异性的“吸附”目标miRNA，从而有效的降低目标miRNA水平，导致miRNA靶基因去抑制化。miRNASponge具有抑制所有具有相同种子序列家族成员的潜力。因此，在研究miRNA种子家族的功能时，miRNASponge技术具有其独特优势。而且，可以通过引入不同的MBS，miRNASponge技术可以同时研究不同miRNA的功能。如何将设计好的MBS，通过酶切反应定向的插入到载体相应位置，最大程度的减少无意义的反向连接，从而快速的获得有效的海绵表达载体，是miRNA海绵构建技术的一个重要难点。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种miRNA海绵表达载体的构建方法及其应用。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种miRNA海绵表达载体的构建方法，所述制备方法至少包括如下步骤：(1)在表达载体骨架中引入包含第一酶切位点的接头序列；(2)将与目标miRNA相互匹配的竞争性抑核苷酸序列的两端分别引入与所述第一酶切位点相匹配的粘端；(3)将(2)中得到的序列插入到(1)中得到的表达载体中，得到miRNA海绵表达载体。本专利技术第二方面提供一种miRNA海绵表达载体，包括表达载体骨架、竞争性抑核苷酸序列、包含第一酶切位点的接头序列；所述竞争性抑核苷酸序列两端分别设有与所述第一酶切位点相匹配的粘端；所述竞争性抑核苷酸序列位于所述接头序列中；所述接头序列与所述表达载体骨架相连。本专利技术第三方面提供一种宿主细胞，能够表达前述miRNA海绵表达载体。本专利技术第四方面提供前述miRNA海绵表达载体的构建方法在miRNA功能研究中的用途。如上所述，本专利技术的miRNA海绵表达载体的构建方法及其应用，具有以下有益效果：本研究设计了一种快速构建miRNA海绵的方法，只需通过一次单酶切反应即可获得数量可观定向插入MBS的“海绵”，此方法即简化了实验步骤降低，又保证了MBS与载体的定向插入，从而减少了MBS无意义的反向连接，增加了miRNA海绵表达载体构建的成功率。附图说明图1显示为本专利技术构建miRNA海绵重组表达质粒策略示意图。图2显示为本专利技术miRNA-17～92MBS和海绵设计设计示意图。图3显示为包含有PpuMI酶切位点的Linker设计序列。图4显示为miRNA-17～92海绵重组腺病毒表达载体构建示意图。图5显示为Linker重组质粒经PpuMI酶切鉴定。图6显示为Ad-miR-17～92海绵重组质粒测序鉴定。图7显示为包含不同MBS的miR-17～92海绵抑制VSMC中miR-17～92的表达情况。具体实施方式本专利技术提供的miRNA海绵表达载体的构建方法，所述制备方法至少包括如下步骤：(1)在表达载体骨架中引入包含第一酶切位点的接头序列；(2)将与目标miRNA相互匹配的竞争性抑核苷酸序列的两端分别引入与所述第一酶切位点相匹配的粘端；(3)将(2)中得到的序列插入到(1)中得到的表达载体中，得到miRNA海绵表达载体。在一种实施方式中，步骤(1)中，所述第一酶切位点选自PpuMI酶切位点或SanDI酶切位点。与目标miRNA相互匹配的竞争性抑核苷酸序列是指，含有能够在严紧条件下与目标miRNA基因杂交的核苷酸序列。与目标miRNA相互匹配是指，所述竞争性抑核苷酸序列与目标miRNA基因中的3-20个连续的核苷酸序列基本互补。较佳的，所述竞争性抑核苷酸序列与目标miRNA中的8-18个连续的核苷酸序列基本互补；所述竞争性抑核苷酸序列与目标miRNA基因中的12、13或14个连续的核苷酸序列基本互补。在一种实施方式中，步骤(2)中，所述粘端选自5′-GTC粘端和3′-CAG粘端。在一种实施方式中，步骤(1)中，所述接头序列中还包括PspXI酶切位点、EcoRV酶切位点、Xbal酶切位点、BglII酶切位点中的一种或多种。在一种实施方式中，所述接头序列(Linker)依次包括所述接头序列依次包括PspXI酶切位点、EcoRV酶切位点、PpuMI酶切位点、Xbal酶切位点、BglII酶切位点。本专利技术首先在表达载体中引入包含PpuMI酶切位点的Linker，并在MBS的末端引入酶切位点5′-GTC和3′-CAG粘端，可以与经PpuMI酶切后的Linker互补连接，从而封死切口，且连接后的左侧形成非酶切序列，而右侧一直保留PpuMI酶切位点，继续酶切反应继续插入MBS，直到终止酶切反应，MBS的插入才停止，因此，单向定向连接方式产生带有不同数量MBS的Sponge。所述接头序列含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是(5’-GTCGG-3’，3’-CCCAG-5’)。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA海绵表达载体的构建方法，其特征在于，所述制备方法至少包括如下步骤：/n(1)在表达载体骨架中引入包含第一酶切位点的接头序列；/n(2)将与目标miRNA相互匹配的竞争性抑核苷酸序列的两端分别引入与所述第一酶切位点相匹配的粘端；/n(3)将(2)中得到的序列插入到(1)中得到的表达载体中，得到miRNA海绵表达载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种miRNA海绵表达载体的构建方法，其特征在于，所述制备方法至少包括如下步骤：
(1)在表达载体骨架中引入包含第一酶切位点的接头序列；
(2)将与目标miRNA相互匹配的竞争性抑核苷酸序列的两端分别引入与所述第一酶切位点相匹配的粘端；
(3)将(2)中得到的序列插入到(1)中得到的表达载体中，得到miRNA海绵表达载体。


2.根据权利要求1所述的miRNA海绵表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述第一酶切位点选自PpuMI酶切位点或SanDI酶切位点。


3.根据权利要求2所述的miRNA海绵表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，所述粘端选自5′-GTC粘端和3′-CAG粘端。


4.根据权利要求2所述的miRNA海绵表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述接头序列中还包括PspXI酶切位点、EcoRV酶切位点、Xbal酶切位点、BglII酶切位点中的一种或多种。


5.根据权利要求4所述的miRNA海绵表达载体的构建方法，其特征在于：所述接头序列依次包括PspXI酶切位点、EcoRV酶切位点、PpuMI酶切位点、Xbal酶切位点、BglII酶切位点。


6.根据权利要求1所述的miRNA海绵表达载体的构建方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)步骤(2)中，所述竞争性抑核苷酸序列的数量不小于2个；
2)所述竞争性抑核苷酸序列与目标miRNA的第9-12位碱基错配；

【专利技术属性】
技术研发人员：王小文，黄春，向小勇，蒋迎九，吴庆琛，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50