基因修饰间充质干细胞、制备方法、应用及细胞治疗产品技术

本发明专利技术提供了一种基因修饰间充质干细胞、制备方法、应用及细胞治疗产品，涉及生物技术、基因治疗和药物开发技术领域，本发明专利技术提供的基因修饰间充质干细胞的制备方法，包括使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2‑4h后冻存，得到基因修饰间充质干细胞。该方法工艺简单，操作方便，可批量生产，且无需昂贵的仪器即可实现，能够有效节约成本。同时，应用本方法制备得到的基因修饰间充质干细胞修饰基因的表达与新鲜制备的细胞无明显差异，在节约时间成本的基础上，可保障修饰基因稳定地表达，从而进一步保证基因修饰间充质干细胞的活力和疗效。

Gene modified mesenchymal stem cells, preparation method, application and cell therapy products

【技术实现步骤摘要】
基因修饰间充质干细胞、制备方法、应用及细胞治疗产品
本专利技术涉及生物技术、基因治疗和药物开发
，尤其是涉及一种基因修饰间充质干细胞、制备方法、应用及细胞治疗产品。
技术介绍
干细胞具有自我更新和定向分化潜能，已证实可促进多种组织损伤的修复，如放射性肺损伤、慢性肝损伤、溃疡性结肠炎等。而间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)是重要的成体干细胞，具有高度自我更新能力、多向分化潜能和取材方便等优点而使其倍受关注，加上其具有免疫豁免的优势，MSCs是干细胞治疗的理想细胞类型。MSC在多种疾病的基础和临床研究中疗效显著，包括心肌梗塞、神经系统、糖尿病、软骨和骨损伤、克罗恩病、移植物抗宿主病(GVHD)等。然而，在疾病的损伤局部，往往存在显著的缺血缺氧、炎症、氧化应激等病理生理环境，可显著降低移植MSCs的存活和效能，进而影响MSCs的治疗效果难以达到预期。因此，通过基因修饰获得增强型MSCs，提升MSCs在损伤部位存活与植入，对于扩展和增强MSCs的应用与疗效具有重要意义。MSCs在组织和器官损伤修复中的作用和机制，主要包括以下几个方面：(1)定向分化作用：MSCs可归巢至受损伤局部，在刺激因子的作用下，分化为特定类型细胞(如肠上皮细胞细胞等)，修复损伤组织并恢复组织功能；(2)免疫与炎症调节作用：MSCs能够抑制多种免疫细胞活性(如DC，T、B淋巴细胞和NK细胞等)，并抑制多种炎症因子的分泌(如IFN-γ、IL-12、TNF-α等)；同时，还能通过分泌IL-4、IL-10等多种抗炎因子，抑制巨噬细胞和T淋巴细胞功能，进而对抗IL-1、IL-6、IL-8等引起的炎症反应；(3)促进组织细胞的再生：通过释放多种生长因子，如血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialcellgrowthfactor，VEGF)，胰岛素样生长因子(insulinlikegrowthfactor，IGF-1)，HGF等，发挥抗凋亡、促增殖、促血管生成等作用，进而达到促进组织修复的目的；(4)其他：MSCs还可通过多种机制抑制疾病的进展，如MSCs可以通过抑制I型和III型胶原的沉积以及基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP-1)等基因和蛋白的表达，抑制组织和器官纤维化进程。MSCs虽然有广泛的炎症调节、组织修复与再生等功能，但其无法有效针对疾病发生、发展的关键分子或环节。因此，其临床疗效往往很难达到预期。通过基因修饰手段增强MSCs在损伤局部的定植与分化，抑制疾病发生发展的关键环节，对于提升MSCs的治疗效果具有重要意义。目前，基因修饰MSCs治疗研究处于起步阶段，大多数方案采用新鲜制备的细胞。新鲜制备细胞虽然具有细胞活力高等优势，但也存在制备成本高(不能批量生产)、质量控制困难(细胞制备后质检时间有限)、成药性差等缺陷。建立一种可冻存的、高效的基因修饰MSCs产品的制备方法，对于提高MSCs的成药性具有重要意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种基因修饰间充质干细胞的制备方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。本专利技术的第二个目的在于提供由上述制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞。本专利技术的第三个目的在于提供上述制备方法或基因修饰间充质干细胞在制备细胞治疗产品中的应用。本专利技术的第四个目的在于提供一种细胞治疗产品。本专利技术的第五个目的在于提供上述细胞治疗产品在制备治疗百草枯中毒的产品中的应用。本专利技术提供了一种基因修饰间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括：使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2-4h后冻存，得到所述基因修饰间充质干细胞。进一步的，所述修饰的时间为3h。进一步的，所述重组腺病毒包括缺陷型重组腺病毒，优选包括Ad.HGF、Ad.DCN或Ad.luc。进一步的，所述重组腺病毒的感染复数为80-150MOI，优选为100MOI。进一步的，所述间充质干细胞包括牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。本专利技术还提供了应用上述的制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞。本专利技术还提供了上述的制备方法或基因修饰间充质干细胞在制备细胞治疗产品中的应用。进一步的，所述细胞治疗产品包括细胞治疗药物；优选地，所述细胞治疗药物包括外用细胞治疗药物或注射细胞治疗药物。本专利技术还提供了一种细胞治疗产品，所述细胞治疗产品包括上述的基因修饰间充质干细胞；优选地，所述细胞治疗产品包括细胞治疗药物；优选地，所述细胞治疗药物包括外用细胞治疗药物或注射细胞治疗药物。本专利技术还提供了上述的细胞治疗产品在制备治疗百草枯中毒的产品中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的基因修饰间充质干细胞的制备方法，包括使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2-4h后冻存，得到基因修饰间充质干细胞。该方法工艺简单，操作方便，可批量生产，且无需昂贵的仪器即可实现，能够有效节约成本。重组腺病毒具有宿主范围广的优点，可广泛适用于不同间充质干细胞的修饰，且应用重组腺病毒修饰后的间充质干细胞能够对疾病发生、发展的关键分子或环节，有效提升治疗效果。同时，该制备方法在重组腺病毒对间充质干细胞修饰2-4h后冻存即可，质检时间充裕，能够有效控制基因修饰间充质干细胞的质量。且相比于更长的修饰时间如修饰24h或48h后再冻存，应用本方法制备得到的基因修饰间充质干细胞修饰基因的表达与新鲜制备的细胞无明显差异，在节约时间成本的基础上，可保障修饰基因稳定地表达，从而进一步保证基因修饰间充质干细胞的活力和疗效。本专利技术提供的基因修饰间充质干细胞，应用本专利技术提供的制备方法制备得到，该基因修饰间充质干细胞可作为原液在液氮长期保存，复苏后不影响其目的基因的表达效率及在体内的存活，可有效提升基因修饰间充质干细胞的成药性。此外，本专利技术的专利技术人通过实验发现，应用本专利技术提供的制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞，在百草枯中毒小鼠的治疗中，与单纯的间充质干细胞相比，可显著提升小鼠的存活率，有望扩展基因修饰间充质干细胞的临床应用，提升百草枯中毒的救治水平。附图说明图1A为本专利技术实施例2提供的牙髓间充质干细胞PE标记异型对照的流式细胞术检测结果；图1B为本专利技术实施例2提供的牙髓间充质干细胞HLA-DR的流式细胞术检测结果；图1C为本专利技术实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD105的流式细胞术检测结果；图1D为本专利技术实施例2提供的牙髓间充质干细胞FITC标记异型对照的流式细胞术检测结果；图1E为本专利技术实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD45的流式细胞术检测结果；图1F为本专利技术实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD19的流式细胞术检测结果；...

【技术保护点】
1.一种基因修饰间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2-4h后冻存，得到所述基因修饰间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因修饰间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2-4h后冻存，得到所述基因修饰间充质干细胞。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述修饰的时间为3h。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组腺病毒包括缺陷型重组腺病毒，优选包括Ad.HGF、Ad.DCN或Ad.luc。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组腺病毒的感染复数为80-150MOI，优选为100MOI。


5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨月峰，吴祖泽，李有凤，朱晓娜，王华，刘冬梅，王立生，毕建进，孙彦洵，
申请(专利权)人：北京三有利和泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11