一种联合调控系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及蛋白表达领域，尤其涉及一种联合调控系统及其应用，所述系统包括Tet‑On调控系统和DDD调控系统，所述Tet‑On调控系统和DDD调控系统融合表达在一个载体上。所述联合调控系统能够实现降低单独使用一种调控系统的本底的目的，从而实现联合调控系统在不需表达目标蛋白时具有更低本底目的蛋白表达量。

【技术实现步骤摘要】
一种联合调控系统及其应用
本专利技术涉及蛋白表达领域，尤其涉及一种联合调控系统及其应用，具体为以Tet-On和DDD调控系统为基础的联合调控系统的构建及其在表达目标蛋白时的应用。
技术介绍
Tet系统是利用四环素操纵子建立起来的一个在真核细胞中调控外源基因表达的一个成熟的调控系统，具有高效、无毒等特点。首先被建立的是反式激活的Tet-off系统，后来通过改造Tet-off系统中的tetR蛋白的基因编码的4个氨基酸，分别将71位的Glu突变为Lys，95位的Asp突变为Asn，101位的Leu突变为Ser，102位的Gly突变为Asp获得了可以正向诱导的Tet-on系统，通过在环境中添加四环素或者强力霉素时，rtTA可以与四环素或者强力霉素结合，然后与TetO结合启动下游基因转录，当撤去四环素或者强力霉素时下游基因不会转录，以此调控目的基因的转录。Tet-On调控系统目前存在缺陷，当不添加四环素或者强力霉素时依然有部分目的基因可以转录，因此使用Tet-On调控系统在不需要转录时会有较高的背景。CN107557389A公开了一种微囊化hBMP-2/Tet-on系统的构建方法，该专利技术将Tet-on系统与hBMP-2同时构建于慢病毒载体上，提高了两个系统的转染效率和表达，更加稳定和持续表达目的基因。CN103993029A公开了利用四环素调控的dcf1基因诱导表达载体及其构建方法，该专利技术利用四环素来调控DCF1在哺乳动物中表达，与ptTS-Neo一起完成调控。当这两个利用Tet-on系统调控表达都存在无需转录背景较高的问题。DDD(DHFRdegradationdomain)调控系统是一种利用泛素蛋白酶系统对目的蛋白进行调控的调控系统，它利用大肠杆菌的二氢叶酸还原酶(ecDHFR)与目标蛋白融合通过控制稳定剂添加与否对目的蛋白进行蛋白水平的调控。ecDHFR可以被DHFR抑制剂甲氧苄氨嘧啶(TMP)所稳定。当没有添加稳定剂TMP时，ecDHFR及与其融合的蛋白会被泛素标记，然后被蛋白酶体识别并降解，从而实现目的蛋白的不表达。而当添加稳定剂TMP时，TMP会与ecDHFR结合并且稳定ecDHFR，从而使ecDHFR及与其融合的蛋白保持稳定的状态不被泛素化降解，目的蛋白可以正常表达。TMP与ecDHFR结合从而稳定蛋白不被降解这个状态是可逆的，添加TMP可以稳定ecDHFR，而撤走TMP会导致ecDHFR及其融合蛋白的降解，所以通过控制TMP的量可以控制目的蛋白的表达水平。DDD调控系统中使用到的稳定剂甲氧苄氨嘧啶TMP是一种常用并且廉价的人用药，可以直接在人体上使用，所以DDD调控药TMP可以用于人体的调节实验而不用经过额外的药物审批。另外TMP对DHFR有很强的稳定效果，而TMP对ecDHFR的稳定作用比哺乳动物的DHFR更强，所以只需要很小量的TMP就可以稳定ecDHFR，所以使用DDD调控系统的调控成本比较低。除此以外，TMP还能够通过血脑屏障以及胎盘屏障，所以DDD可以用于调控不同时期，不同范围的蛋白表达，具有很广阔的应用空间。CN1618955A公开了一种CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统，该系统能够实现外源基因在CHO/dhfr-细胞基因组中定点整合和有效表达，该系统可用于重组蛋白在CHO/dhfr-细胞中的高表达研究，可见，dhfr系统(DDD调控系统)是一种使用方便，应用广泛的蛋白调控系统，但与Tet-On系统类似，DDD调控系统也存在一定缺陷，在撤去TMP时同样存在部分目的蛋白不降解。现有技术中，并没有将两种调控系统联合的现有技术，也没有给出是否能够将两种系统联合使用，两种系统联合使用会带来什么样效果的技术启示。
技术实现思路
针对目前存在的问题，本专利技术提供一种联合调控系统及其应用，所述联合调控系统能够实现降低单独使用一种调控系统的本底的目的。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种联合调控系统，所述系统包括Tet-On调控系统和DDD调控系统，所述Tet-On调控系统和DDD调控系统融合表达在一个载体上。本专利技术中，专利技术人发现在单独使用Tet-on调控系统时，在不添加诱导剂诱导目标基因转录的情况下，实际上仍然有部分目标基因可以转录从而造成较高的本地表达，单独使用DDD调控系统，在不添加稳定剂的情况下，实际上仍然有部分的目标蛋白残留不被讲解；专利技术人发现将这两个调控系统通过一定的方式进行联合表达，这两个系统不仅能发挥原来系统的作用效果，其调控效果还能进一步相互叠加，解决本地表达较高的问题，降低了不需表达目标蛋白时的本底表达水平。根据本专利技术，所述Tet-On调控系统包括rTRAD元件和TetO7元件，所述rTRAD元件位于单独的表达框内，所述TetO7元件位于目标基因表达框启动子的5’端。根据本专利技术，所述rTRAD元件的核酸序列如SEQIDNO.1所示，具体SEQIDNO.1所示的核酸序列如下：atgtctagactggacaagagcaaagtcataaactctgctctggaattactcaatggagtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctgccaatcgagatgctggacaggcatcatacccactcctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcataccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggaacaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgaaacaagcaattgagctgttcgaccggcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcggggataaaaataatatgaaccatataccatattataacgatatgaataataacataacaaattatgctaacatgactggaatacaaaatttaaataatatgaatccaataatgatcgatccaaataataatgctgattctgtggaagagttttatgatgcaatcgatggatgtaatgtggttgataccaattatatggtaggtacaaataatatgattgatcaaattcattttaatgatgtaactagtaatgtaggaaatatgaat本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种联合调控系统，其特征在于，所述系统包括Tet-On调控系统和DDD调控系统，所述Tet-On调控系统和DDD调控系统融合表达在一个载体上。/n

【技术特征摘要】
1.一种联合调控系统，其特征在于，所述系统包括Tet-On调控系统和DDD调控系统，所述Tet-On调控系统和DDD调控系统融合表达在一个载体上。


2.根据权利要求1所述的联合调控系统，其特征在于，所述Tet-On调控系统包括rTRAD元件和TetO7元件；
优选地，所述rTRAD元件位于单独的表达框内，所述TetO7元件位于目标基因表达框启动子的5’端。


3.根据权利要求1或2所述的联合调控系统，其特征在于，所述rTRAD元件的核酸序列如SEQIDNO.1所示；
优选地，所述TetO7元件的核酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的联合调控系统，其特征在于，所述DDD调控系统包括ecDHFR元件；
优选地，所述ecDHFR元件位于目标基因的表达框内。


5.根据权利要求1-4中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶铸，梁兴祥，李晓芬，卢俊南，李姣姣，赵思婷，陈小平，秦莉，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44